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1、阳离子脂质体介导DNA聚合酶反义寡核苷酸转染并抑制人肝癌细胞的生长DNA-pol是真核生物细胞DNA合成的关键酶，与肿瘤的发生及发展密切相关1。其在肿瘤细胞中含量增加，酶活性增强mRNA高表达2。因此以polmRNA为靶核酸而构建的反义寡核苷酸(ASODN)可进入细胞内与靶mRNA特异互补结合，抑制其翻译，使DNA-pol的表达减少，从而抑制了人胃3、肝、人卵巢及乳腺等癌细胞的增殖。我们选用阳离子脂质体脂染素(lipofection,Lip)与ASODN形成复合物，通过Lip介导使靶细胞快速大量摄入ASODN，并躲避细胞内外各种酶的降解，以增强其生物效应。1.材料与方法：(1)人肝癌细胞系HC
2、C-9204、SMMC-7721的来源及培养、互补于人DNA-pol催化亚基mRNA翻译起始区的含18个核苷酸的ASODN及相应正义寡核苷酸(SODN)片段的合成及碱基顺序、噻唑蓝(MTT)法及流式细胞仪(FCM)技术参见我们的既往报告3。(2)阳离子脂质体(Lip)。(3)Lip加寡核苷酸(ODN)复合物的制备：入肝癌细胞HCC-9204和SMMC-7721分别设Lip加ASODN、Lip加SODN2个实验组及1个空白Lip对照组，每种细胞有8个实验组和1个对照组，每组设3个复孔，共27孔。培养后用MTT法测定细胞存活状态，FCM分析细胞DNA含量，最后结果取3个复孔的均值。2.结果：(1)
3、Lip加ODN对人肝癌细胞生长的抑制作用：Lip加ASOND可显著抑制HCC-9204人肝癌细胞的增殖，其半数抑制浓度约为10g/ml，是游离ASOND半数抑制浓度的十分之一。当ASODN浓度小于10g/ml时，其与Lip复合物对肝癌细胞生长抑制的作用不明显(P0.05)，而当ASODN浓度为20g/ml时，这种作用并未显著增强。Lip+SODN同游离状态SODN一样，对HCC-9204的增殖无明显抑制作用(P0.05)。SMMC-7721人肝癌细胞与HCC-9204的结果类似(资料略)。(2)Lip加ODN抑制肝癌细胞DNA的合成：DNA指数(DI)可表示细胞内DNA相对含量。以鸡红细胞作二
4、倍体对照，人肝癌细胞DI值=癌细胞G0/G0期峰均值/鸡红细胞G0/G1期峰均值。析因分析FCM检测所得的结果，表明Lip+ODN可使人肝癌细胞DNA合成显著减少。3.讨论：肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。在治疗研究上至今未摆脱传统的综合治疗方法。基因治疗有望在下个世纪攻克癌症，而反义技术又是其中的热点。ASODN可在mRNA的剪接、转录和翻译等水平抑制基因的表达，通过下调与肿瘤发生发展密度相关的基因、分子及酶的表达而特异性地杀伤癌细胞。本研究应用人DNA-pol特异的ASODN有效抑制肝癌细胞的增殖，对基因治疗肝癌进行了初步的探索。ODN一般由数个至数十个核苷酸残基通过磷酸二酯键连接而成。为
5、克服细胞屏障，利用载体将ASODN导入靶细胞是行之有效的方法。1987年Felgner等首次用人工合成的阳离子脂质体N-1-(2，3-二油酰氧)丙基-N1N1N-氧化三甲铵(DOTMA)构建小单层脂质体，与DNA自发作用形成脂质体-DNA复合物，促进了DNA的细胞摄入及胞内的稳定表达。后来的研究又进一步发现有中性磷脂参与构成的阳离子脂质体活性更强。而Lip即是由阳离子脂质(DOTMA)和中性磷脂二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE合成的脂质体。适用于将各种核酸导入培养的细胞内。其机理是阳离子脂质体通过静电引力作用与带负电荷的核酸自发形成复合物，净电荷为正的复合物又很容易结合到带负电荷的细胞表面，与细胞融
6、合，通过细胞内吞作用进入胞内。因此它与传统脂质体不同，并非将核酸包入脂质体囊内，而是结合到表面，只需混合即可俘获几乎100%的核酸，而传统脂质体的核酸包裹率不到10%。与硫酸钙共沉淀法或二乙氨乙基(DEAE)-葡聚糖方法相比，应用Lip的核酸转染效率要高出5100倍。因此阳离子脂质体应用方便，优势明显，近几年被广泛用于将DNA，RNA和蛋白质导入活细胞。但关于应用此类脂质体介导相对小分子的ASODN转染活细胞的报道罕见。1989年Stoolman研究发现，DOTMA可使细胞摄入ASODN的量增加10倍以上，而且因为显著改变了其在细胞内的情况使ASODN的生物活性增强了100倍。1991年Chi
7、ang等首次在哺乳动物细胞中证实阳离子脂质体可使ASODN的作用明显增强。1994年Nestle等将Lip与靶向细胞间粘合分子1(ICAM-1)mRNA的ASODN混合后作用于角细胞，使ICAM-1的表达减少50%，而无Lip介导时仅减少30%。本实验也表明人DNA-polmRNA特异的ASODN在Lip介导下抑制人肝癌细胞增殖的作用增强了10倍。因此Lip可望成为简单有效的运载工具，介导ASODN进入体外培养或体内细胞，解决细胞摄入困难的问题。作者单位：程黎阳陈国广州军区总医院普通外科忠广州市510010高毅杨继震广州第一军医大学珠江医院普通外科510282参考文献1程黎阳，高毅，杨继震.DNA聚合酶与肿瘤.医学综述，1997，3：227-229.2高毅，张晓华，杨继震.人胃癌组织DNA聚合酶 mRNA的高表达.第一军医大学学报，1994，14：182-185.3程黎阳，高毅，杨继震.DNA聚合酶反义寡核苷酸抑制人胃癌细胞生长.新消化病学杂志，1996，4：666-668.收稿：1998-11-04
