《1人血清类胰蛋白酶含量测定方法的建立2类胰蛋白酶引起ecv304细胞表达il1β、il8和scf变化的机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《1人血清类胰蛋白酶含量测定方法的建立2类胰蛋白酶引起ecv304细胞表达il1β、il8和scf变化的机制研究（51页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、复旦大学 硕士学位论文 1人血清类胰蛋白酶含量测定方法的建立;2类胰蛋白酶引起 ECV304细胞表达IL-1、IL-8和SCF变化的机制研究 姓名：陆超 申请学位级别：硕士 专业：病理生理学 指导教师：殷莲华 20040501 肥大细胞类胰蛋白酶促炎机制研究 中文摘要 第一部分人血清类胰蛋白酶含量测定方法的建立 类胰蛋白酶是肥大细胞分泌颗粒中特有的一类四聚体丝氨酸蛋白酶，J 下常情 况下仅有少量分泌，但在肥大细胞相关的疾病，如过敏性休克、哮喘、风湿性关 节炎、肥大细胞增多症等，可使肥大细胞脱颗粒，类胰蛋白酶大量释放，血清浓 度急剧升高。因此，检测血清中类胰蛋白酶的含量有助于相关疾病的诊断。正常
2、 情况下，类胰蛋白酶在血中的含量非常低，国内目前还没有很好的检测手段。我 们制备并提纯了类胰蛋白酶的单克隆抗体，建立了较为敏感的双抗体夹心酶联免 疫吸附试验( E L I S A ) 法，能够检测到正常人血清中的类胰蛋白酶，为国内此类疾 病的诊断提供了依据。 我们将能够分泌类胰蛋白酶的杂交瘤细胞株种植到b a l b c 小鼠腹腔，取其 腹水，用蛋白A 亲和层析法提取抗类胰蛋白酶抗体，用酶联免疫吸附试验法检 测类胰蛋白酶的水平。并且对随机抽取的正常人血清标本，以及过敏性休克死亡 患者血清，使用E L I S A 法检测了类胰蛋白酶的水平。 2 0 6 份上海市正常人血清类胰蛋白酶含量的平均值为
3、2 2 4 4 - 0 1 2 n g m l 。1 例 过敏性休克死者血清的类胰蛋白酶含量明显升高( 大于正常值5 0 倍) 。 我们制备并提纯了类胰蛋白酶的单克隆抗体，建立的E L I S A 法能够检测人血 清中类胰蛋自酶，获得了上海地区正常人类胰蛋白酶血清浓度，为肥大细胞相关 疾病的临床诊断提供了实验依据。 第二部分类胰蛋白酶引起E C V 3 0 4 细胞表达I L 1 1 3 和I L 一8 变化的机制研究 炎症反应不仅仅局限于传统的范围，在肿瘤、动脉粥样硬化以及神经退行性 病变等疾病的发生发展中也都有参与，并发挥了重要作用。因而，炎症在这些疾 病中是怎样发挥作用及其作用机制的重要
4、性是目前迫切需要解决的问题。肥大细 胞分泌的类胰蛋白酶通过诱导血管炎症反应和促进炎症细胞在局部聚集，在炎症 反应中起了重要作用。内皮细胞不仅仅是一个作为被动分隔血液和周围组织的机 械屏障，由于处在血液和组织交接处，这使得它可以调节致炎物质的流入或流出 炎症区域；内皮细胞还能够表达干细胞生长因子( s t e mc e l lf a c t o r ，S C F ) ，S C F 对肥大细胞具有很强的趋化作用，还可促使其增殖、分化、成熟、激活，因此内 皮细胞在炎症反应中具有非常关键的作用。类胰蛋白酶是通过激活内皮细胞膜表 面上的P A R 2 受体而发挥作用的，但P A R 2 的激活受多种因素
5、的影响，C o m p t o n 等人报道P A R 2 的激活依赖于受体的基因结构，而且，缺少肝素的作用类胰蛋白 酶将会失去活性。因此，研究类胰蛋白酶、血管内皮细胞以及P A R 2 的激活与炎 症之问的相互关系以及阐明与炎症有关的疾病机制非常重要。 本实验用R T P C R ，N o r t h e r nb l o t 方法检测类胰蛋白酶刺激后内皮细胞炎症 介质I L 一1B 、I L 一8 和干细胞生长因子( s t e mc e l lf a c t o r ，S C F ) 表达情况，并用 W e s t e r n b l o t 方法研究类胰蛋白酶对P A R 2 受体的激
6、活作用。 结果表明，类胰蛋白酶能够激活人脐静脉内皮细胞膜的P A R 2 受体，促进人 脐静脉内皮细胞的I L 1B 、I L 一8m R N A 、S C Fm R N A 表达上调，这些作用可以 被P A R 2 单克隆抗体所抑制。 类胰蛋白酶能够通过激活人脐静脉内皮细胞膜受体P A R 2 促进炎症介质 I L 1B 和I L 一8 表达，并通过产生S C F ，促进肥大细胞在局部聚集和激活，加剧 局部炎症反应。 P A R T l A B S T A C T E s t a b l i s h m e n to fan e wd e t e c t i v e a s s a y o
7、f t r y p t a s e i nh u m a ns e r u m T r y p t a s e ，ap r e d o m i n a n ts e r i n ep r o t e a s eo f m a s tc e i l ，i sr e l e a s e db ym a s tc e l l d e g r a n u l a t i o n S e r u mt r y p t a s el e v e li sv e r yl o w i nn o m a ls u b j e c t s ；h o w e v e r ，i tc a r lb e d r a
8、m a t i c a l l yi n c r e a s e di nt h es e r u n o fm a s tc e l lr e l a t e dd e s e a s e ss u c ha sa n a p h y l a c t i c s h o c k ，a t h e m a ，r h e u m a t o i da r t h r i t i sa n dm a s t o e y t o s i s ，i nw h i c hm a s tc e l lh a sb e e n a c t i v a t e da n dt h e nr e a l e a
9、 s e dt r y p t a s eb yd e g r a n u l a t i o n D e t e c t i o no fs e r u n lt r y p t a s e l e v e lc a nb eu s e dt od i a g n o s es u c hd e s e a s e s O w n i n gt ot h ev e r yl o wl e v e l ，t h e r ei sn o g o o dm e t h o dt o d e t e c ti ti nC h i n au n t i ln o w S o ，w ee x t r a
10、 c t e da n dp u r i f i e dt h e m o n o c l o n a la n t i b o d i e st o t r y p t a s e a n de s t a b l i s h e dan e ws e n s i t i v ee n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ( E L I S A ) t od e t e c tt h el e v e lo ft r y p t a s ei nn o r m a lh u m a ns e r a ， w h i c
11、 hc a ng i v es o m e s u p p o r t f o rt h ed i a g n o s i so f m a s tc e l lr e l a t e dd e s e a s e s W e p l a n t e dh y b r i d o m a c e l l sw h i c hc a r ls e c r e t em o n o c l o n a la n t i b o d i e st ot r y p t a s e t ob a l b cm i c ea n de m p l o y e dP r o t e i n Ac o l
12、u m nt op u f f f ya n t i b o d i e sf r o mt h ea s c i t e s o fm i c e M a s tc e l lt r y p t a s ew a sm e a s u r e db yE L I S Ai n2 0 6n o r m a lh u m a ns e r aa n d o n ep o s t m o r t e ms e r u m o f a n a p h y l a c t i cs h o c k T h em e a nl e v e lo ft r y p t a s e i nn o r m a
13、 l s u b j e c t s s e r a f r o m s h a I l g h a i w a s 2 2 4 1 0 12 n g m 1 T h el e v e lo ft h ep o s tm o g e ms e r u mw a se l e v a t e d5 0t i m e st h a n n o r m a l l e v e l s W e g o tt h e m o n o c l o n a la n t i b i e st ot r y p t a s ea n de s t a b l i s h e da l lE L I S Aw
14、h i c hc a n d e t e c t t r y p t a s es e n s i t i v e l y ，a l s ow e d e t e c t e dt h em e a nl e v e lo fn o m a ls e r ao fs h a n g h a i h u m a n ，w h i c hc a np r o v i d eau s e f u l d a t af o rc l i n i c a ld i a g n o s i so fm a s tc e l lr e l a t e d d i s e a s e P A R T 2 S
15、t u d y o nt h em e c h a n i s mo fc h a n g e si nI L - 11 3 ， I L 一8a n dS C Fi n d u c e d b yt r y p t a s e T h er e c e n tr e s e a r c h e sh a v ep r o v e dt h a ti n f l a m m a t i o n sn o to n l ye x i s ti nt r a d i t i o n a ld i s e a s e s b u ta l s op l a ya l li m p o r t a n
16、tr o l ei nt u m o r ，a t h e r o s c l e r o s i sa n dC N Sd e s e a s e s I ti so fg r e a t i m p o r t a n c et of i g u r eo u th o w i n f l a m m a t i o n si n f l u e n c eo nt h ed i s e a s e s T r y p t a s eh a s p r o - i n f l a m m a t i o na b i l i t y ，P u r i f i e dh u m a nt r y p t a s ec a ni n d u c e v a s c u l a ri n f l a m m a t i o n s a n dc o n g r e g a t i o no fi n f l a m m a t i o nc e l l s N ol o n g e r r e g a r d e ds i m
