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1、血栓素合酶反义核酸抗内毒素血症大鼠血栓形成的研究摘要目的研究反义寡核苷酸(ODN)对大鼠血栓形成的影响。方法鼠静脉注射反义寡核苷酸(ODN)，20 O.D./200?g体重，检测其对血浆TXA2浓度及血栓形成的影响。结果经ODN注射以后，内毒素血症大鼠血浆TXA2水平从(2951.8588.3)ng/L，降至(433.925.7)?ng/L，(P0.001)；相应的血栓湿重分别为(17.84.0)mg和(11.23.1)?mg (P0.01)。结论ODN能减轻由内毒素所引起的TXA2生成增加及血栓形成加强。关键词反义寡核苷酸内毒素血栓素A2血栓形成Effect of TXS antisense
2、 oligodeoxynucleotide on thrombosis in endotoxemia rats WEI Zelan, WANG Dixun. Department of Pathophysiology, School of Basic Medical Scrences, Tongji Medical University, Wuhan 430030Abstract Objective To investigate the effect of antisense oligodeoxynucleotide (ODN) on the thrombosis of rat. Method
3、s The selected ODN against rat thromboxane synthase was infected intravenously via the tail vein at a dose of 20 OD/200 g in rats. The plasma level of TXA2 and the thrombus weight were determined. Results ODN decreased the plasma level of TXA2 in rat with endotoxemia from (1951.8588.2) ng/L to (433.
4、925.7) ng/L (P0.001) and the wet weight of thrombus from (17.84.0) mg to (11.23.1) mg (P0.01). Conclusion ODN can reduce the production of TXA2 and thrombosis caused by exogenous lipopolysaccharide.Key words Antisense oligodeoxynucleotide Endotoxin TXA2Thrombosis内毒素(LPS)可通过各种途径引起机体微血管舒缩功能紊乱，微血管通透性增高
5、，血浆渗出，血液淤滞，血小板相互碰撞，释放内源性花生四烯酸，生成TXA2，后者作用于血小板TXA2受体，促进血小板聚集及血栓形成。针对血栓素合酶(TXS)cDNA设计的反义核酸，体外实验已证明它能抑制TXA2的合成1。本实验旨在研究在体条件下对TXA2生成和血栓形成的影响。材料与方法1. 反义ODNs的设计、合成与修饰针对大鼠血栓素合酶(TXS)cDNA设计了3条反义ODNs片段：ODN，ODN，ODN。经体外实验证明ODN为有效抑制血栓素合酶基因表达的片段，其序列为5-TGAGAAGCCCCAACACTT-3。以其错义ODN作为对照，序列为5-CTTACACCAGCCGAATGA-3，与TX
6、S基因比较，无结合的可能。以上片段由上海Sangonm公司经亚磷酸酰胺法合成全硫代修饰的ODNs，PAGE纯化鉴定，紫外分光定量。2. 大鼠内毒素血症模型的复制2及实验分组雄性SD大鼠，体重200g左右。LPS(E.Coli 055B5第二军医大微生物)溶于pH7.4 PBS溶液，按50g/kg体重一次性尾静脉注射复制内毒素血症模型。动物分4组：(1)正常对照组：同体积PBS静脉注射；(2)LPS组：仅注射LPS；(3)消炎痛+LPS组：先给消炎痛10mg/kg体重腹腔注射，30分钟后再注射LPS，作为阳性对照组；(4)ODN+LPS组：先以ODN 20 O.D./200g体重静脉注射，6小时
7、后再注射LPS。各组在给LPS后半小时，测定由丝线引起的血栓湿重；同时分离血浆，采用解放军总医院试剂盒，以放射免疫方法检测TXA2的稳定代射产物TXB2的含量，以此反映TXA2的产量。3. 血栓形成实验大鼠称重，以20%乌拉坦0.5ml/kg体重腹腔注射麻醉。分离右颈外静脉，左颈总动脉。在聚乙烯管的中段放入一根长6cm(重4mg)丝线。用肝素生理盐水充满聚乙烯管后将管一端插入右颈外静脉，准确注入肝素(50U/kg)抗凝，然后，另一端插入左颈总动脉，使血液从颈总动脉经聚乙烯管流入颈外静脉，回入心脏。血液流动15分钟后，迅速取出管中丝线称重，总重量减去丝线重即为血栓湿重。4. 统计学方法t检验。结
8、果1. ODN对血浆TXB2水平的影响内毒素血症时，血浆TXB2含量为(2951.8588.2)ng/L，明显高于正常对照组的(600.2154.8)ng/L。消炎痛、ODN均能降低内毒素血症大鼠的血浆TXB2水平，分别为(138.166.8)ng/L，(433.925.7)ng/L，与LPS组比较，P0.001。错义ODN无此作用。2. ODN对血栓形成的影响LPS可明显增加血栓的形成，消炎痛和ODN均可逆转LPS的作用，而错义ODN无作用。血栓湿重分别为：对照组(12.41.9)mg，消炎痛组(11.80.8)mg，LPS组(17.84.0)mg，与对照组相比，P0.05。消炎痛+LPS组
9、(12.30.8)mg，ODN+LPS组(11.23.1)mg，与LPS组相比，P0.01。错义ODN+LPS组(15.12.1)mg。讨论LPS不仅刺激血小板释放TXA2，同时也刺激血单核细胞释放TXA2，使血浆中TXA2水平大幅度上升。本实验中大鼠在内毒素血症时，血浆中TXA2水平升高近正常的5倍，血栓重量也相应比正常明显增加。非甾体抗炎药消炎痛可完全抑制正常巨噬细胞和LPS刺激的巨噬细胞生成TXA2，有很强的抑制血小板聚集作用。所以，用消炎痛后，大鼠血浆TXA2浓度显著下降，不仅低于LPS组，也低于正常组；血栓湿重与正常组相比有所下降，比LPS组明显下降。在花生四烯酸向TXA2的转变过程
10、中，前三步反应的酶均可受LPS诱导而活性增强3，最后一步血栓素合酶成为TXA2合成的限速步骤。我们筛选的ODN就是通过抑制TXS合成，降低TXS基础表达，达到降低TXA2合成的目的。因血小板无合成TXS的能力，所以ODN只作用于除血小板之外其他产生TXA2的细胞，如血浆单核细胞和组织巨噬细胞。因而其作用不及消炎痛迅速，抑制效率不及消炎痛高。本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39400052)作者单位：430030武汉，同济医科大学基础医学院病理生理教研室参考文献1魏泽兰，胡清华，王迪浔.反义核酸抑制血栓素合酶的基因表达.中国病理生理杂志，1998，14：595-598.2 范明，朱振汉，
11、王迪浔.前列腺素和白三烯在内毒素所致肺动脉高压中的意义.同济医科大学学报，1991，20：225-228.3Matsumoto H, Naraba H, Murakami M. Concordant induction of prostaglandin E2 synthase with cyclooxygenase-2 leads to preferred production of prostaglandin E2 over thromboxane and prostaglandin D2 in lipopolysaccharide-stimulated rat peritoneal macrophages. Biochem Biophys Res Commu,1997,230:110-114.
