血清学试验

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1、第九章 血清学试验9-1 血清学试验概述一、血清学试验的概念概念：抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。因抗体主要存在于血清中，所以将体外发生的抗原抗体结合反应称为血清学反应或血清学试验。在体内发生的抗原抗体反应是体液免疫应答的效应作用。二、血清学试验的特点 （一）特异性和交叉性 （二）敏感性 （三）可逆性 （四）反应的二阶段性 （五）最适比例与带现象 （六）用已知测未知 三、影响血清学试验的因素 （一）电解质常用0.85%0.9%（人、畜）或8%10%（禽）的氯化钠或各种缓冲液（免疫标记技术）作为抗原和抗体的稀释液或反应液。 （二）温度在一定温度范围内，温度越高，加速抗原

2、抗体结合和反应现象的出现。 （三）酸碱度血清学试验要求在一定的pH下进行，常用的pH值为68， （四）振荡适当的机械振荡能加速抗原抗体的结合反应 （五）杂质和异物每批血清学试验都应设阳性对照和阴性对照试验。四、血清学试验的应用及发展趋向 （一）血清学试验的应用 传染病、寄生虫病、肿瘤、自身免疫病、变态反应性疾病的确诊。在动物疫病的群体检疫、疫苗免疫效果监测和流行病学调查。生物活性物质的超微定量、物种及微生物鉴定和分型等方面。基因分离，克隆筛选，表达产物的定性、定量分析和纯化等，已经成为现代分子生物学研究的重要手段。 （二）血清学试验的发展趋向反应的微量化和自动化方法的标准化和试剂的商品化技术的

3、敏感特异和精密化检测技术的系列化方法简便快速。 9-2 凝集试验一、凝集试验的概念凝集试验：细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶等颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，经过一定时间，复合物互相凝聚形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验（Agglutination test）。参与凝集试验的抗原称凝集原，抗体称凝集素。 二、凝集试验的类型 （一）直接凝集试验(Direct agglutination test)颗粒性抗原与相应抗体直接结合并出现凝集现象的试验称直接凝集试验。按操作方法可分为玻片法和试管法两种。1.玻片法 为一种定性试验用途：（1）新分离菌的鉴

4、定或定型，如沙门氏菌、链球菌的鉴定、血型的鉴定等（2）用已知的诊断抗原悬液检测待检血清中是否存在相应的抗体。如：布氏杆菌的玻板凝集试验和鸡白痢全血平板凝集试验等。2.试管法 是一种定量试验用途：用以检测待检血清中是否存在相应抗体和检测该抗体的效价（滴度），应用于临床诊断或流行病学调查。生产中此法常用于布氏杆菌病的诊断与检疫。 （二）间接凝集试验(Indirect agglutination test) 间接凝集试验：将可溶性抗原(或抗体)先吸附于一种与免疫无关、一定大小的不溶性颗粒的表面，然后与相应的抗体(或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，所发生的特异性凝集反应，称为间接凝集试验（图1

5、1-2）。 间接凝集反应原理示意图 抗原致敏载体颗粒已致敏的载体颗粒与相应抗体反应产生凝集正向间接凝集反应将抗原吸附于载体颗粒，然后与相应的抗体反应产生的凝集现象，称为正向间接凝集反应，又称正向被动间接凝集反应。反向间接凝集反应将特异性抗体吸附于载体颗粒表面，再与相应的可溶性抗原结合产生的凝集现象，称为反向间接凝集反应。1.间接血凝试验间接血凝试验是以红细胞为载体的间接凝集试验。应用：多种疫病的诊断和检疫，如病毒性传染病、支原体病、寄生虫病的诊断与检疫。2乳胶凝集试验载体为乳胶又称胶乳，是聚苯乙烯聚合的高分子乳状液3.协同凝集试验载体是一种金黄色葡萄球菌细胞壁上的葡萄球菌A蛋白(SPA)应用：

6、多种细菌病和某些病毒病的快速诊断。9-3 沉淀试验一、沉淀试验的概念沉淀试验：可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等)与相应的抗体结合，在适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（Precipitation reaction test）。参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。二、沉淀试验的类型 （一）环状沉淀试验（ring precipitation test） 用于抗原的定性试验，如诊断炭疽的Ascoli试验、链球菌的血清型鉴定、血迹鉴定。 （二）琼脂凝胶扩散试验 简称琼扩1.概念1%琼脂凝胶的孔径约为85nm，因

7、为凝胶网孔中充满水分，小于孔径的抗原或抗体分子可在琼脂凝胶中自由扩散，由近及远形成浓度梯度，当二者在比例适当处相遇时，即可发生沉淀反应，因形成的抗原抗体复合物为大于凝胶孔径的颗粒，不能在凝胶中再扩散，就在凝胶中形成肉眼可见的沉淀带，称此试验为琼脂凝胶扩散试验。2.琼脂扩散分四类单向单扩散 单向双扩散 双向单扩散 双向双扩散。（1）双向单扩散 又称辐射扩散 应用：传染病的诊断，如鸡马立克氏病的诊断。（2）双向双扩散 应用最广泛应用：细菌、病毒的鉴定和传染病的诊断。如检测口蹄疫、马立克氏病、禽流感、传染性法氏囊病的琼脂扩散方法。双扩散用于检测抗体 琼脂扩散四种基本类型（据陆承平） 双扩散用于检测抗

8、体（据陆承平） （三）免疫电泳免疫电泳技术是把凝胶扩散试验与电泳技术相结合的免疫检测技术。优点：在琼脂扩散的基础上，提高了反应速度、反应灵敏度和分辨率。在临床上应用比较广泛的有对流免疫电泳和火箭免疫电泳等。1.对流免疫电泳是将双向双扩散与电泳技术相结合的免疫检测技术。用于多种传染病的快速诊断。如口蹄疫、猪传染性水疱病等病毒病的诊断。2.火箭免疫电泳是将辐射扩散与电泳技术相结合的一项检测技术，简称火箭电泳。将pH8.28.6的巴比妥缓冲液琼脂融化后，冷至56左右，加入一定量的已知抗血清，浇成含有抗体的琼脂凝胶板。在板的负极端打一列孔，孔径3mm，孔距8mm，滴加待检抗原和已知抗原，电泳210h。

9、电泳时，抗原在含抗血清的凝胶板中向正极迁移，其前锋与抗体接触，形成火箭状沉淀弧，随抗原继续向前移动，此火箭状锋亦不断向前推移，原来的沉淀弧由于抗原过量而重新溶解。最后抗原抗体达到平衡时，即形成稳定的火箭状沉淀弧（图11-6）。在试验中由于抗体浓度保持不变，因而火箭沉淀弧的高度与抗原浓度呈正比，本法多用于检测抗原的量（用已知浓度抗原作对比）。9-4 补体结合试验 一、基本原理本试验包括两个系统共五种成分：检测系统（溶菌系统）：即已知的抗原（或抗体）、被检的抗体(或抗原)和补体；指示系统（溶血系统）：包括绵羊红细胞、溶血素和补体。二、补体结合试验的基本过程及应用基本过程：第一步为反应系统作用阶段第

10、二步是溶血系统作用阶段观察结果：最终表现是不溶血，说明待检的抗体与相应的抗原结合，结果是阳性；最终表现是溶血，说明待检的抗体不存在或与抗原不相对应，结果是阴性。应用：1.诊断传染病，如结核、副结核、鼻疽、牛肺疫、马传染性贫血、乙型脑炎、布氏杆菌病、钩端螺旋体病、锥虫病等。2.鉴定病原体，如对流行性乙型脑炎病毒的鉴定和口蹄疫病毒的定型等。9-5 中和试验 根据抗体能否中和病毒的感染性而建立的免疫学试验，称中和试验(Neutralization test）。中和试验极为特异和敏感，既能定性又能定量，主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、病毒抗原性的分析、疫苗免疫原性的评价、血清抗体效价的

11、检测等。中和试验可在体内进行也可在体外进行。体内中和试验也称保护试验，试验时先对实验动物接种疫苗或抗血清，间隔一定时间后，再用一定量病毒攻击，最后根据动物是否得到保护来判定结果。常用于疫苗免疫原性的评价和抗血清的质量评价。体外中和试验是将抗血清与病毒混合，在适当条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，以检测混合液中病毒的感染力。根据保护效果的差异，判断该病毒是否已被中和，并可计算中和指数，即中和抗体的效价。根据测定方法不同，中和试验有终点法中和试验和空斑减数法中和试验等方法。毒素和抗毒素也可进行中和试验。其方法与病毒的中和试验基本相同。一、终点法中和试验终点法中和试验（Endpoin

12、t neutralization test）是滴定使病毒感染力减少至50%时，血清的中和效价或中和指数。有固定病毒稀释血清和固定血清稀释病毒两种方法。 （一）固定病毒稀释血清法将已知的病毒量固定，血清作倍比稀释，常用于测定抗血清的中和效价。1.病毒毒价单位病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，但由于剂量的递增与死亡率递增的关系不是一条直线，而是呈S形曲线，在越接近100死亡时，对剂量的递增越不敏感。而死亡率愈接近50%时，剂量与死亡率呈直线关系，所以现基本上采用半数致死量(LD50)作为毒价单位，而且LD50的计算应用了统计学方法，减少了个体差异的影响，因此比较准确。以感染发病作

13、为指标的，可用半数感染量(ID50)。用鸡胚测定时，可用鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)；用细胞培养测定时，可用组织细胞半数感染量(TCID50)。在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。2.病毒毒价测定将病毒原液作10倍递进稀释即10-1、10-2、10-3，选择46个稀释倍数接种一定体重的试验动物(或鸡胚、细胞)，每组36只(个、孔)。接种后，观察一定时间内的死亡(或出现细胞病变)数和生存数。根据累计死亡数和生存数计算致死百分率。然后按Reed-Muench法、内插法或Karber法计算半数剂量。以TCID50测定为例说明如下

14、：按Karber法计算，其公式为lgTCID50=L+d(S-0.5)，L为病毒最低稀释度的对数；d为组距，即稀释系数，10倍递进稀释时d为-1；S为死亡比值之和（计算固定病毒稀释血清法中和试验效价时，S应为保护比值之和），即各组死亡（感染）数/试验数相加。若以测定某种病毒的TCID50为例，病毒作10-410-7稀释，记录其出现细胞病变（CPE）的情况（表9-1）。则L=-4，d=-1，S=6/6+5/6+2/6+0/6=2.16lgTCID50=(-4)+(-1)(2.16-0.5)=-5.66。TCID50=10-5.66，0.1ml。TCID50为毒价的单位，表示该病毒经稀释至10-5.66（1/105.66）时，每孔细胞接种0.1ml，可使50%的细胞孔出现CPE。而病毒的毒价通常以每ml或每mg含多少TCID50或（LD50等）表示。如上述病毒的毒价为105.66 TCID50/0.1ml，即106.66 TCID50/ml。表9-1 病毒毒价滴定(接种剂量0.1ml)病毒稀释CPE阳性数阴性数%10-410-510-610-765200146100833303.正式试验将病毒原液稀释成每一单位剂量含20