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1、第十一章 血清学试验默认分类 2006-12-03 23:08:04 阅读271 评论0 字号：大中小 第十一章 血清学试验内容提要 血清学试验是体外发生的抗原抗体反应，根据可见的现象判定反应结果。凝集试验用颗粒性抗原，有直接法、间接法等。沉淀试验用可溶性抗原，有环状沉淀、琼脂免疫扩散、免疫电泳等方法。标记抗体技术尤其是荧光抗体与酶标抗体技术发展迅速、应用广泛。荧光抗体标记有直接法及间接法，酶标记抗体技术有免疫酶组化法及ELISA两类。补体结合试验需有补体系统和溶血系统共同参与。中和试验有体内中和试验和体外中和试验之分。各种检测技术的原理、方法及对试验的特别要求应予注意。第一节 血清学试验概述
2、一、血清学试验的概念 抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。在体内发生的抗原抗体反应是体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于检测抗原或抗体，用于免疫学诊断。因抗体主要存在于血清中，所以将体外发生的抗原抗体结合反应称为血清学反应或血清学试验。血清学试验具有高度的特异性，广泛应用于微生物的鉴定、传染病及寄生虫病的诊断和监测。二、血清学试验的特点 （一）特异性和交叉性 抗原抗体的特异性结合是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子可变区结合的特异性，是由两者之间空间结构互补决定的。抗原与相应抗体的结合具有高度的特异性，主要依靠抗原分
3、子上的抗原决定簇和抗体末端可变区的氨基酸排列和立体构型，只有抗原决定簇的立体构型和抗体分子的立体构型完全吻合，才能发生反应。如抗新城疫病毒的抗体只能与新城疫病毒结合，而不能与其他病毒结合。但较大分子的蛋白质常含有多种抗原决定簇，如果两种不同的抗原之间含有部分共同的抗原决定簇，则发生交叉反应。如肠炎沙门氏菌的抗血清能凝集鼠伤寒沙门氏菌。一般来说亲缘关系越近，交叉反应的程度越高。根据抗原抗体反应高度特异性的特点，在疾病诊断中可用抗原、抗体任何一方作为已知条件来检测另一未知方。 （二）敏感性 抗原抗体的结合还具有高度敏感性的特点，不仅可检测定性，还可以定量检测微量、极微量的抗原或抗体，其敏感度大大超
4、过当前所应用的化学分析方法。血清学试验的敏感性视其种类而异（表111）。表111血清学试验敏感性比较测定方法敏感性（每升）双向免疫扩散试验1mg火箭电泳0.5mg对流电泳0.1mg免疫电泳510mg凝集试验1g血凝抑制试验0.1g补体结合试验0.1g放射免疫分析法1pg酶联免疫吸附试验1ng定量免疫荧光分析1pg（三）可逆性 抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这种结合是可逆的，结合条件为040、pH49。如温度超过60或pH降到3以下，或加入解离剂（如硫氰化钾、尿素等）时，则抗原抗体复合物又可重新解离，并且分离后抗原或抗体的性质仍不改变。免疫技术中的亲合层析法，常用改变pH和离子强度促使抗原抗
5、体复合物解离，从而纯化抗原或抗体。（四）反应的二阶段性 第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，此阶段反应快、仅数秒至数分钟，但不出现可见反应。第二阶段为可见阶段，这一阶段抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、pH、温度、补体）的影响下出现各种可见反应，如表现为凝集、沉淀、补体结合等。此阶段反应慢、需数分钟、数十分钟或更久。第二阶段受电解质、pH、温度等因素的影响。（五）最适比例与带现象 大多数抗体为二价，抗原为多价，因此只有两者比例合适时，才能形成彼此连接的大复合物，血清学反应才出现凝集、沉淀等可见的反应现象（图11-1）。如果抗原过多或抗体过多，则抗原与抗体的结合不能形成大复合物，抑制可见反应
6、的出现，称为带现象。当抗体过量时，称为前带；抗原过多时，称为后带。为克服带现象，在进行血清学反应时，需将抗原或抗体作适当稀释，通常是固定一种成分，稀释另一种成分。（六）用已知测未知 所有的血清学试验都是用已知抗原测定未知抗体，或用已知抗体测定未知抗原。在反应中只能有一种材料是未知的，但可以用两种或两种以上的已知材料检测一种未知抗原或抗体。三、影响血清学试验的因素（一）电解质 抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为疏水胶体的过程中，须有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，水化层破坏，复合物相互靠拢聚集形成大块的凝集或沉淀。若无电解质参加，则不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成
7、，常用0.85%0.9%（人、畜）或8%10%（禽）的氯化钠或各种缓冲液（免疫标记技术）作为抗原和抗体的稀释液或反应液。但电解质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。（二）温度 在一定温度范围内，温度越高，抗原、抗体分子运动速度越快，这可以增加其碰撞的机会，加速抗原抗体结合和反应现象的出现，如凝集和沉淀反应通常在37水浴感作（即将试验材料加盖保湿恒温作用）一定时间，以促进反应现象的出现，若用56水浴则反应更快。但有的抗原抗体结合则需长时间在低温下，才能使反应完成的比较充分、彻底，如有的补体结合试验在04冰箱结合效果更好。（三）酸碱度 血清学试验要求在一定的pH下进行，常用的pH值为68，过高或过
8、低，均可使已结合的抗原抗体复合物重新解离。若pH降至抗原或抗体的等电点时，会发生非特异性的酸凝集，造成假象。（四）振荡 适当的机械振荡能增加分子或颗粒间的相互碰撞，加速抗原抗体的结合反应，但强烈的振荡可使抗原抗体复合物解离。（五）杂质和异物 试验介质中如有与反应无关的杂质、异物（如蛋白质、类脂质、多糖等物质）存在时，会抑制反应的进行或引起非特异性反应，故每批血清学试验都应设阳性对照和阴性对照试验。四、血清学试验的应用及发展趋向近年来，血清学试验由于与现代科学技术相结合，发展很快。加之半抗原连接技术的发展，几乎所有小分子活性物质均能制成人工复合抗原，以制备相应抗体，从而建立血清学检测技术，使血清
9、学技术的应用范围愈来愈广，涉及到生命科学的所有领域，成为生命科学进入分子水平不可缺少的检测手段。(一)血清学试验的应用 血清学试验在医学和兽医学领域已广泛应用，可直接或间接从传染病、寄生虫病、肿瘤、自身免疫病和变态反应性疾病的感染组织、血清、体液中检出相应的抗原或抗体，从而作出确切诊断。对传染病来说，几乎没有不能用血清学试验确诊的疾病。实验室只要备有各种诊断试剂盒和相应的设备，即可对多种疾病作出确切诊断。在动物疫病的群体检疫、疫苗免疫效果监测和流行病学调查中，也已广泛应用了血清学试验以检测抗原或抗体。血清学试验还广泛应用于生物活性物质的超微定量、物种及微生物鉴定和分型等方面。此外，血清学试验也
10、用于基因分离，克隆筛选，表达产物的定性、定量分析和纯化等，已经成为现代分子生物学研究的重要手段。（二）血清学试验的发展趋向随着免疫学技术的飞速发展，在原有经典免疫学实验方法的基础上，新的免疫学测定方法不断出现，在抗原-抗体反应基础上发展起来的固相载体、免疫比浊、放射免疫、酶联免疫、荧光免疫、发光免疫及免疫学的生物传感技术和流式免疫微球分析都极大地推动了免疫学和生物化学的融合，促进了各种自动化免疫分析仪的推出和应用，如散射比浊、化学发光、电化学发光、酶免疫分析、荧光偏振、微粒子酶免疫分析、荧光酶标免疫分析等。使血清学试验具有更高的特异性、高度敏感性、精密的分辨能力以及简便快速的特点。进一步的发展
11、趋势是：血清学试验的发展趋向应该是反应的微量化和自动化，方法的标准化和试剂的商品化，技术的敏感、特异和精密化，检测技术的系列化以及方法简便快速。第二节 凝集试验一、凝集试验的概念细菌、红细胞等颗粒性抗原，或吸附在红细胞、乳胶等颗粒性载体表面的可溶性抗原，与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，经过一定时间，复合物互相凝聚形成肉眼可见的凝集团块，称为凝集试验（Agglutination test）。参与凝集试验的抗原称凝集原，抗体称凝集素。参与凝集试验的抗体主要为IgG和IgM。凝集试验可用于检测抗体或抗原，最突出的优点是操作简便，便于基层的诊断工作。二、凝集试验的类型 凝集试验根据抗原的性质、
12、反应方式的不同，可分为直接凝集试验和间接凝集试验。(一)直接凝集试验(Direct agglutination test) 颗粒性抗原与相应抗体直接结合并出现凝集现象的试验称直接凝集试验。按操作方法可分为玻片法和试管法两种。1.玻片法 为一种定性试验，在玻璃板或瓷片上进行。将含有已知抗体的诊断血清与待检悬液各一滴在玻板上混合，数分钟后，如出现颗粒状或絮状凝集，即为阳性反应。此法简便快速，适用于新分离菌的鉴定或定型，如沙门氏菌、链球菌的鉴定、血型的鉴定等多采用此法。也可用已知的诊断抗原悬液，检测待检血清中是否存在相应的抗体，如布氏杆菌的玻板凝集试验和鸡白痢全血平板凝集试验等。2.试管法 是一种定
13、量试验，在试管中进行，用以检测待检血清中是否存在相应抗体和检测该抗体的效价（滴度），应用于临床诊断或流行病学调查。操作时，将待检血清用生理盐水作倍比稀释，然后加入等量一定浓度的抗原，混匀，37水浴或温箱数小时后观察。视不同凝集程度记录为（100%凝集）、（75%凝集）、（50%）、（25%凝集）和（不凝集）。根据每管内细菌的凝集程度判定血清中抗体的含量。以出现50凝集（）以上的血清最高稀释倍数为该血清的凝集价(或称效价、滴度)。生产中此法常用于布氏杆菌病的诊断与检疫。(二)间接凝集试验(Indirect agglutination test) 将可溶性抗原(或抗体)先吸附于一种与免疫无关、一定
14、大小的不溶性颗粒的表面，然后与相应的抗体(或抗原)作用，在有电解质存在的适宜条件下，所发生的特异性凝集反应，称为间接凝集试验（图11-2）。用于吸附抗原(或抗体)的颗粒称为载体颗粒，常用的载体有红细胞、聚苯乙烯乳胶，其次是活性炭、白陶土、离子交换树脂等。将可溶性抗原吸附到载体颗粒表面的过程称为致敏。1.间接血凝试验 间接血凝试验是以红细胞为载体的间接凝集试验。将可溶性抗原致敏于红细胞表面，用以检测未知抗体，在与相应抗体反应时出现肉眼可见现象，称此为正向间接血凝试验。如将已知抗体吸附于红细胞表面，用以检测样本中相应抗原，致敏红细胞在与相应抗原反应时发生凝集，称为反向间接血凝试验。由于红细胞几乎能
15、吸附任何抗原，而红细胞是否凝集又容易观察。因此，利用红细胞作载体进行的间接血凝试验广泛应用于多种疫病的诊断和检疫，如病毒性传染病、支原体病、寄生虫病的诊断与检疫。2乳胶凝集试验 乳胶又称胶乳，是聚苯乙烯聚合的高分子乳状液，乳胶微球直径约0.8m,对蛋白质、核酸等大分子物质具有良好的吸附性能，用它作载体吸附抗原（或抗体），可用以检测相应的抗体（或抗原）。本法具有快速简便，保存方便、比较准确等优点。 3.协同凝集试验 该试验中的载体是一种金黄色葡萄球菌，此菌的细胞壁上含有葡萄球菌A蛋白(SPA)，SPA能与人和大多数哺乳动物血清中IgG分子的Fc片段发生结合，并将IgG分子的Fab段暴露于葡萄球菌的表面，并保持其活性。当结合于葡萄球菌表面的抗体与相应抗原结合时，形成肉眼可见的小凝集块，该方法称为协同凝集试验。此法已广泛应用于多种细菌病和某些病毒病的快速诊断。第三节 沉淀试验一、沉淀试验的概念可溶性抗原(如细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液，病毒的可溶性抗原、血清、组织浸出液等)与相应的抗体结合，在适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀试验（Precipitation reaction test）。参与沉淀试验的抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。二、沉淀试验的类型沉淀试验可分为液相沉淀试验和固相沉淀试验，液相沉淀试
