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1、新霉素耐药基因(NeoR)的整合与表达并不改变人乳癌细胞(MDA)的原有生物学特性*摘要目的：通过对比MDA-NeoR与MDA人乳癌细胞的生物学特征，阐明原核标志基因NeoR的长期稳定整合与表达是否对乳癌细胞原有的生物学特性产生影响。方法：对已建立且证实表达NeoR基因6个月的7株MDA-NeoR细胞系进行G418抗性、表面抗原、细胞倍增时间、细胞周期、肿瘤细胞集落形成及裸鼠体内成瘤能力的检测。结果：MDA-NeoR细胞对高浓度的G418仍产生抗性并表达NeoR基因；其细胞倍增时间、S期分数、肿瘤细胞体外集落形成率与MDA无明显区别(P0.05)；角蛋白CK19与表面膜抗原EMA的表达在两组是
2、等同的；并且MDA-NeoR 7细胞系在裸鼠体内的成瘤能力与MDA细胞也是相似的。结论：外源标志基因NeoR的长期稳定整合与表达对MDA人乳癌细胞的原有生物学特性无明显影响。主题词乳房；癌；细胞；新霉素；基因；生物学 Biological characteristics of human breast cancer cell line (MDA) expressing neomycin resistance gene (NeoR)GUO Si-Qi,XI Yong-Zhi,SONG San-Tai,JIN Li,CHEN Xing-Guo,KONG Fan-HuaLaboratory of I
3、mmunology, Affiliated Hospital for Academy of Military Medical Sciences, Beijing (100039)Abstract AIM: To compare the biological characters of MDA cell line with MDA-NeoR cell lines, those of expressing neomycin resistance gene (NeoR). METHODS: Several biological characters were identified. They are
4、 G418 (geneticin) resistance, the expression of cell membrane antigens, double-cell time, the fraction of cell cycle phase, the numbers of tumor colony formation in vitro and the tumor formation ratio of nude mice in vivo.RESULTS: MDA-NeoR cells cultured in vitro for six months are still endurable f
5、or G418(6105 U/L); The expression of CK19 (cytokeratin 19) and epithelial membrane antigen detected by (flow cytometer ) are negative; Double-cell time, the ratio of cell in S phase, and the colony formation numbers in vitro are insignificant statistically (P0.05) between MDA and MDA-NeoR cell lines
6、; The tumor formation ratio of nude mice in vivo of MDA and one of MDA-NeoR cell lines are 1/4 and 2/5 respectively, have no difference. CONCLUSION: The integration and expression of hetrogenious NeoR gene do not make any changes in the characters of MDA.MeSHBreast; Carcinoma; Cells; Neomycin; Genes
7、; Biology 为了深入探索乳癌细胞的生物学特性、转移、浸润、微小病变的检测以及自身造血干细胞移植前的净化新策略，新近我们已成功地建立了特异性表达原核标志基因NeoR(neomycin resistance gene，新霉素耐药基因)的人乳癌细胞模型。由于迄今为止所有的转基因方法均缺乏组织特异性或定向性，所转外源基因达不到基因打靶或基因定点整合，因此有可能使整合的外源基因激活靶细胞的原癌基因、灭活抗癌基因、启动转化基因等其它相关的功能性基因，从而引起靶细胞的一系列原有生物学特性的改变。为此，全面系统地阐明NeoR基因在MDA(MDA-MB-231，乳癌细胞系)细胞基因组中的长期稳定整合与表
8、达能否改变该细胞原有的生物学特性显得尤为重要，这也是该模型在被广泛应用之前必须阐明的关键问题。材料与方法(一)材料：MDA-MB-231由军事医学科学院三所陆应麟教授馈赠，7株MDA-NeoR(NeoR基因转入MDA-MB-231)细胞由本室建立并培养6个月；鼠抗人角蛋白19(cytokeratin 19, CK19)单抗、表面膜抗原(EMA)单抗和异硫氰酸荧光素(FITC)结合的兔抗鼠二抗为DAKO公司产品，碘化丙锭PI为Sigma公司产品；表皮生长因子(EGF)由军事医学科学院八所朱厚础教授馈赠，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)为日本麒麟公司产品；Balb-c裸鼠购自中国医学科学院
9、。(二)MDA-NeoR细胞对G418(geneticin)的抗性*国家自然科学基金资助(No.39370272)及NeoR基因表达的检测：将MDA-NeoR细胞及MDA原代细胞在含有终浓度为6105 U/L G418的1640培养基中传代培养，观察对G418的抗性；同时提取各细胞的基因组DNA，PCR扩增NeoR基因的特异性产物，以检验NeoR基因的整合。(三)MDA-NeoR细胞倍增时间检测：参照文献1方法。连续计数培养24、48、72及96 h的细胞，取其平均值，分别计算细胞倍增时间，每一种细胞均重复测定3次。(四)MDA-NeoR细胞表面抗原的表达：方法见文献1。细胞浓度为1010/L
10、，抗CK19和抗EMA单抗的浓度为1：50，FITC(异硫氰酸荧光素)结合二抗的浓度为1：15，标记后用FCM检测。(五)MDA-NeoR细胞周期状态的检测1：按设计定时取所培养的细胞用70%酒精固定后4保存。检测时稀释成109个/L，用RNA酶A 5105 U/L于37水浴作用30 min。加PI(碘化丙锭，propidium iodide) 50 mg/L，30 min后上FCM检测细胞周期G0/G1：G2/M：S值，结果以BD公司MODFIT LT软件分析，计算S期分数。(六)MDA-NeoR细胞的集落形成1：培养体系为每毫升含20% FBS、0.3%琼脂、100个细胞的1640液，培养
11、1014 d后在倒置显微镜下计数集落的数目。此外，还分别观察了EGF 100 g/L及GM-CSF 106 U/L对其的影响。(七)MDA-NeoR细胞在裸鼠体内的成瘤能力：将Balb-c裸鼠随机分组，每组6只。选择与MDA细胞生物学特性一致的一株MDA-NeoR细胞按107/只在右侧背部皮下分别接种。观察6周以上，记录两者的成瘤率。(八)统计学处理：采用上海医科大学编的SMUP-PC生物处理系统作单因素方差分析中的成组t检验，SAS软件作二因素析因分析。结果(一)NeoR基因在MDA-NeoR细胞中稳定的整合：在含有G418的培养基中，MDA细胞很快死亡，而MDA-NeoR细胞生长良好，见1
12、。在所有的7株MDA-NeoR细胞中，PCR均扩增出NeoR基因的特异性条带，见2。证明原核NeoR基因已在MDA-NeoR细胞中长期稳定整合。 Fig 1The different growth curves between MDA and MDA-NeoR cell line cultured with G418 (6105 U/L)1MDA细胞及MDA-NeoR细胞在含G418培养条件下的生长曲线Fig 2The results of NeoR gene integration in the MDA-NeoR cell line identified by PCRM:DNA molecu
13、lar marker; 1 lane: MDA cell line; 28 lanes: MDA-NeoR celllines, 9 lane: plasmid positive control2PCR鉴定NeoR基因在转基因后MDA细胞中整合的结果(二)NeoR基因对MDA细胞倍增时间的影响：由表1可见，7株MDA-NeoR细胞中有3株的倍增时间较MDA细胞有所延长，但无明显差别(P0.05)，另4株则与MDA细胞相近。表1MDA与MDA-NeoR乳癌细胞倍增时间和S期分数的比较Tab 1The comparison of double-cell time and fraction of S
14、-phasebetween MDA and MDA-NeoR cell lines (s,n=3)Cell linesDouble-cell time(h)Fraction of sphase(%)MDA26.66.152.2112.81MDA-NeoR126.51.861.812.97MDA-NeoR231.213.561.112.79MDA-NeoR331.25.559.665.79MDA-NeoR425.60.357.9617.65MDA-NeoR532.911.363.733.48MDA-NeoR626.55.064.146.51MDA-NeoR726.96.161.627.78 (三
15、)NeoR基因对MDA细胞周期状态的影响：如表1所示，7株MDA-NeoR细胞的S期分数也无明显改变(P0.05)。(四)NeoR基因对MDA细胞表面抗原的影响：FCM检测的结果显示，MDA及MDA-NeoR细胞均不表达CK19与EMA抗原。同时亦表明NeoR基因的整合并未改变这两种抗原在MDA及MDA-NeoR细胞中的表达。(五)NeoR基因对MDA细胞集落形成能力的影响：在本实验条件下，MDA细胞的平均集落形成率为(864)CFU/100个细胞；而7株MDA-NeoR细胞的与之相似，两组相比无明显差异(P0.05)。并且GM-CSF和EGF对两种细胞的集落形成也无明显刺激或抑制作用，结果见表2。 表2MDA与MDA-NeoR乳癌细胞体外集落形成能力的比较Tab 2A comparison of tumor colony numbers in vitro between MDA and MDA-NeoR cell lines (z0101 (88 bytes) src=/med/cano/201003/
