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1、河北医科大学 硕士学位论文 细胞膜去极化增强KCNQ2/Q3钾电流的分子机制研究 姓名：陈兴娟 申请学位级别：硕士 专业：药理学 指导教师：张海林 20090301 中文摘要 细胞膜去极化增强K C N Q 2 Q 3 钾电流的分子机制 的研究 摘要 钾离子通道( p o t a s s i u mc h a n n e l ) 是选择性允许K 离二子 跨膜通过的离子通道，是目前发现的亚型最多、作用最复杂 的一类离子通道，广泛分布于骨骼肌、神经、血管、气管、 胃肠道、血液及腺体等细胞。钾离子通道在调节细胞的膜电 位和兴奋性以及平滑肌的舒缩活动中起重要作用。K C N Q 基 因编码的外向延迟整
2、流钾离子通道具有六个跨膜结构域和 一个孔区，是钾离子通道家族中一个非常重要的亚家族，这 个家族的两个成员即K C N Q 2 K C N Q 3 ( K v 7 2 K v 7 - 3 ) 是构 成M 电流的分子基础，具有慢激活、非失活的电压依赖外 向钾离子电流特征。 M 电流因能被毒蕈碱受体( m u s c a r i n i cr e c e p t o r ) 强烈抑 制而得名。M 通道在神经系统中分布广泛，除交感神经元外， 在皮层、海马、背根神经元等部位也有分布。M 电流的抑制 将导致神经系统兴奋性升高，而M 通道功能失调与良性家 族性新生儿惊厥症( B F N s ) 、阿尔茨海默
3、氏病( A l z h e i m e r ) 、 癫痫等疾病有关。因此自其发现至今人们做了大量关于M 电流调节机制的研究，G 蛋白偶联的受体激活后信号通路的 下游分子包括P K C 、A K A P l 5 0 、C 。蝴、钙离子、花生四烯 酸及代谢产物等均被证实参与了M 电流的抑制过程。 K C N Q 2 Q 3 离子通道的磷酸化也参j 与了M 电流的调节过程。 研究表明，P I P 2 本身可以激活M 电流，而P I P 2 的水解则是 中文摘要 受体介导的电流抑制的原因之一。P i P 2 ，磷脂酰肌醇一4 ，5 二二 磷酸是信号转导通路中的关键节因二子，P i P 2 的代谢对离子
4、通 道的功能有重要调节作用。经磷脂酶C ( P L C ) 水解后P I P ， 生成D A G 和I P 3 ，二者可作为第二信使分别激活P K C ，促 进细胞内钙库释放。水解的同时P I P 2 的再合成也在不断进行 着，从磷脂酰肌醇磷酸( P I ) 开始，在磷脂酰肌醇磷酸四磷 酸激酶( P 1 4 K ) 催化作用下，肌醇环的四位发生磷酸化生成 P I P ，进而P I P 5 K 以P I P 为底物使肌醇环的五位发生磷酸化 最终生成P I P 2 。P 1 4 K 在P I P 2 的再合成过程中起了重要作用。 而P 1 4 K 主要分布在高尔基体及粗面内质网，P 1 4 K 的
5、激活需 要进行转位到P I 富集的部分发挥磷酸激酶的活性，此外 P 1 4 K 的激活和P K C 的活性有很大关系。 本实验小组在研究表达在爪蟾卵母细胞上K C N Q 2 Q 3 钾电流调节机制过程中发现，细胞膜的持续去极化引起 K C N Q 2 Q 3 电流的增大，同时也发现P K C 的激活剂佛波酯 ( P M A ) 同样在短时间内使K C N Q 2 Q 3 电流增大，本实验 就这一实验现象分别以通道磷酸化、P i P 2 通路等调节途径为 研究对象试图寻找细胞膜去极化引起K C N Q 2 Q 3 电流增二赶 的分子机制。 目的：研究爪蟾卵母细胞中外源性表达的K C N Q 2
6、 和 K C N Q 3 通道蛋白在细胞膜去极化条件下通道磷酸化程度的 改变与去极化所引起电流增大关系。细胞膜去极化引起 K C N Q 2 Q 3 电流的增大与P I P 2 再台成过程中磷脂酰肌醇四 磷酸激酶( P 1 4 K ) 以及P K C 活性的关系。 方法：( 1 ) c R N A 的体外转录：K C N Q 2 和K C N Q 3 通 道克隆在质粒载体p G E M H E 中，其序列已经测序验证。用 中文摘要 适当的限制性内切酶N h e I 将质粒线性化后，用R i b o m a x I M L a r g eS c a l eR N AP r o d u c t i
7、 o nS y s t e m sT 7K i t 体外转录 K C N Q 2 和K C N Q 3 通道的c R N A 。( 2 ) 爪蟾卵母细胞的分 离与注射：在爪蟾冰冻麻醉状态下，取出卵母细胞。在含2 m g m l 胶原酶的O R 2 液中振荡消化1 5 之小时，O R 2 液的成 分为( m M ) N a C l8 2 5 ，K C l2 ，M g C l 21 ，H E P E S5 ( p H7 4 ) 。 待细胞消化为单细胞后用N D 9 6 液清洗细胞，挑选状态良好 的爪蟾卵母细胞进行K C N Q 2 3 通道c R N A 注射，注射后的 细胞在含2 5m M 丙酮
8、酸钠的N D 9 6 中1 9 2 0 培养，N D 9 6 溶液构成为( r a M ) ：N a C l9 6 ，K C ll ，C a C l 21 8 ，M g C l 21 ， H E P E S5 ，p H7 4 。( 3 ) 用双电极电压钳( t w o m i c r o e l e c t r o d e v o l t a g ec l a m p ，T E V C ) 方法检测K C N Q 2 3 通道在卵母细胞 中的表达情况和电流特性。( 4 ) 细胞膜蛋白的提取与免疫 共沉淀：将表达通道的卵母细胞分为对照组和去极化处理组 ( N D 9 6 K 孵育1 5m i n
9、 ) 分别用玻璃匀浆器进行匀浆，4 ， 5 0 0 0g ，离心5r a i n 。取上清，用超速离心机4 ，2 0 0 ，0 0 0g ， 离心1h r ，弃上清，用裂解缓冲液重悬沉淀( 1 斗l 细胞) 。 将提取好的膜蛋白加入特异性抗酩氨酸磷酸化的抗体或者 抗通道抗体，4 。C ，摇床6 0 转每分钟过夜，次日加入p r o t e i n Gb e a d s ，4 ，摇床6 0 转分钟，21 1 r 后洗涤珠子，将纯化 的酪氨酸磷酸化蛋白或通道蛋白免疫复合物进行十二烷基 磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( S D S P A G E ) ，电转移至P V D ，F 膜上，脱脂奶粉封闭后，用特
10、异性一抗和H R 标记或荧光染 料标记的二抗进行检测，显色用D A B 或O d y s s e y 9 1 2 0 双色 红外激光成像系统仪器扫描。检测通道酪氨酸磷酸化的变 化。( 5 ) 细胞全蛋白的提取与免疫印迹：将去极化处理以 中文摘要 及P M A 孵育2 0m i n 的卵母细胞用玻璃匀浆器进行匀浆，4 ，1 2 0 0 0g ，离心3 0m i n 。取上清进行免疫印迹，方法同 前。( 6 ) 细胞免疫荧光：将去极化处理以及P M A 孵育的卵 母细胞用甲醛固定后，用P B S 配制含3 B S A 和O 2 T r i t o n X 10 0 的封闭液进行封闭，加入特异性一抗
11、和荧光标 记的二抗，用激光共聚焦扫描显微镜观察标本显色情况。( 7 ) 免疫组织化学：将去极化处理以及P M A 孵育的卵母细胞用 甲醛固定后脱水、包蜡、切片处理后进行脱蜡抗体修复，进 行特异性抗体免疫。( 8 ) R T P C R ：提取不同组别卵母细胞 的总R N A ，并进行凝胶电泳检测，定量8 0 0n g u l 。以R N A 为模板反转录c D N A ，以P 1 4 K 特异性引物扩增片P 1 4 K 片断， 根据P C R 产物的量指示P 1 4 K 的m R N A 水平的变化。 ( 9 ) R N A 干扰技术：使用R N A i 设计软件设计特异性干扰P 1 4 K
12、的s i R N A 和d s R N A ，同时也设计s i l R l 2 q A 的阴性对照S r a m b l e s m a l lR N A ( s s R N A ，打乱s i R N A 碱基排列顺序、) ，并用化学 合成的的方法以及P C R 技术合成s i R N A ，s s R N A 和d s R N A 的D N A 模板，T 7R i b o M A X T M E x p r e s sR N A iS y s t e m 转录为 双链s i R N A ，s s R N A 和d s R N A ，注射进卵母细胞降低卵母 细胞中P 1 4 K 蛋白的表达，观
13、察K C N Q 2 Q 3 电流的变化。( 1 0 ) P K C 。活性分析：检测去极化以及P M A 孵育条件下P K C 活 性的变化。 结果：( 1 ) 分子生物学实验结果：用限制性核酸内切 酶N h e I 将环状的K C N Q 2 和K C N Q 3 通道的质粒D N A 线性 化，用琼脂糖凝胶( O 8 ) 电泳分析线性化结果。环形的质 粒比线性化完全的质粒D N A 电泳条带走的要快，位置在前 面，通过该电泳带的电泳位置与D N A 质量标准M a r k e r 对照 中文摘要 可粗略得出该质粒D N A 的分子量。体外转录R N A 并进行 电泳分析，用琼脂糖凝胶(
14、1 O ) 电泳方法可得到一条清晰 的R N A 条带，条带均匀整齐无拖尾现象，经R N A 定量， R N A 浓度约为3 5 0n g 1 。( 2 ) K C N Q 2 3 通道表达：向卵母 细胞注射R N A 后的第2 3 天，即可用双电极电压钳制 ( T E V C ) 方法检测到K C N Q 2 Q 3 电流，免疫印迹结果表明 通道蛋白表达良好。( 3 ) 免疫共沉淀观察到细胞膜去极化 处理( 用N D 9 6 K 溶液孵育) 的通道蛋白磷酸化条带并没有 变化，K C N Q 2 和K C N Q 3 通道蛋白的磷酸化程度与正常对 照之比分别为1 0 1 + 0 0 2 ( n
15、 - 6 ) 和0 9 9 + 0 0 3 ( n = 5 ) 。( 4 ) 细胞膜去极化的卵母细胞中被检测到P 1 4 K 蛋白量明显增 加：W e s t e r nb l o t 的免疫印迹条带明显加深，增加的比例分 别为1 4 8 i 0 0 5 ( n = 1 0 ) ，采用免疫荧光，激光共聚焦扫描 显微镜进行观察，细胞膜去极化的卵母细胞荧光强度变化明 显增强，统计荧光强度增加的比例为2 5 4 + 0 5 2 ( n = 7 ) ；细 胞免疫组织化学技术显示荧光强度增加的比例为2 5 4 + 0 3 0 ( n - 8 ) 。但是P 1 4 K 特异性引物所扩增的R T P C R
16、 的条带并 没有明显增加，与正常对照相比1 0 9 + 0 0 9 ( n = 5 ) 。( 5 ) P M A 孵育后的卵母细胞中P 1 4 K 蛋白量明显增加：W e s t e r n b l o t 的免疫印迹条带明显加深，增加的L t - , J 0 0 为1 4 9 + 0 12 ( n = 6 ) ，而使用P M A 无效类似物4 a P M A 处理组没有明 显变化( 1 0 9 + 0 0 6 ，n = 6 ) ；采取免疫荧光，激光共聚焦扫 描显微镜进行观察，P M A 孵育的卵母细胞荧光强度变化明 显增强，统计荧光强度增加的比例为1 9 8 ：k 0 2 3 ( n = 6 ) ；细 胞免疫组织化学技术显示荧光强度增加的比例为1 9 8 + 0 2 3 ( n = 7 ) 。但是P 1 4 K 特异性引物所扩增的R T P C R 的条带并 中文摘要 没有明显增加，与正常对照相比1 0 7 + 0 1 6 ( n = 5
