脑功挠胲与的动态平衡调控

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1、项目名称： 脑功能的动态平衡调控首席科学家： 陈军 中国人民解放军第四军医大学起止年限： 2006.1 至 2010.12依托部门： 总后勤部卫生部一、研究内容总体研究内容脑功能稳态是确保人类正常生命活动的首要基础，它是中枢神经系统在基因与细胞表面分子和胞内信号分子网络、突触网络、神经回路网络及脑各个系统网络等多个层次上对身体内外环境瞬息万变的复杂信息进行动态反馈调节，达到兴奋与抑制的可塑性稳态过程。该过程反映了脑是高度进化的产物，涉及基因与分子网络的稳态，神经元、神经胶质细胞与突触可塑性的稳态，神 经回路的稳态，脑可塑性稳态等四个层 面复杂的信息处理和精确的神经分析计算过程，任何水平上的错误

2、信息处理和计算都可能导致这个平衡系统的失调和紊乱，因此在21 世纪人类社会活动高度频繁和经济社会高度精神与躯体负担压力下，脑具有极强的功能失调易感性，造成人类疾病谱的排行首榜向神经与精神疾病转化，结果导致人的工作能力丧失、生活质量下降， 给社会和家庭造成极大的经济和精神负担，恶 化人类社会环境。脑功能紊乱与疾病（如慢性疼痛、药物成瘾、癫痫、精神分裂症、睡眠障碍、痴呆和脑高级功能障碍等）不 仅是脑本身的健康问题， 还会导致身体其它系统的疾病（如癌症、心血管疾病、胃 溃疡和胃功能异常、内分泌紊乱和脑源性代谢病-糖尿病等）。系统深入地研究“脑 功能的动态平衡调控” 细胞分子机理将有助于在多个层次上理

3、解脑功能，并为防治功能性脑疾病提供策略和方法，因此本项目具有重要的科学和社会意义，是国家重要的科学前沿问题。本项目将紧紧围绕“ 脑功能的 动态平衡调控” 这个关键 的科学问题，在基因与分子网络的稳态，神经元、神经胶质细胞与突触可塑性的稳态 ，神 经回路的稳态，脑可塑性稳态与行为等四个层面上，针对（1） 电压门 控离子通道的 调 控 ；（2）细 胞分泌与内吞的 调 控机理 ；（3）抑制性突触及其可塑性 ；（4）神 经 信号的精确分析 计 算的机理 ；（5）视 网膜神 经 回路的信息 处 理 ；（6）果 蝇长时记忆 的分子机理 ；（7）猴 长时记忆 的集群神 经 元 编码 ；（8）应 激行 为 与

4、神 经 可塑性 稳态 等 8 个研究课题深入开展研究。一1一 电压门 控离子通道的 调 控 ：研究电压门控通道在神经细胞内外离子稳态、信号产生、信号传导、时序编码和调控上的功能特点具有重要的生物学意义。 该课题拟采用电生理细胞外记录、膜片钳记录和爪蟾卵母细胞双电极记录，分子生物学新型离子通道的克隆与表达、基因修饰、 杂合体构建，神经药理学神经递质动态微透析检测、分子成像、相关神经毒素与离体膜离子通道标记结合、生物大分子相互作用实时检测，色谱分离纯化与鉴定， 动物行为学以及免疫组化形态学等综合技术手段，并结合若干国产资源特异性钠或钾离子通道配体/调制剂，构建新型 BmNa 及其相关钠离子通道亚型

5、以及 BKca 钾离子通道分子模板等，全面系统地研究电压门控钠离子通道和相关钾离子通道参与脑稳态神经信号处理过程的分子细胞调控机制、网络关联通径及其信息整合特征。在离子通道的突变与演化关联，相关离子通道/ 受体与特异性配体/调制剂相互识别结合的敏感度和靶位点的定位与突变等若干重大理论问题的探讨中，推进认同国产资源相关特异性离子通道/受体配体/调制剂的实际应用价值，增进了解电压门控通道在神经细胞内外离子稳态、信号产生、信号传导、时序编码和 调控上的功能特点。同时注意研究非电压敏感性 Na+通道和非选择性阳离子通道的结构与功能。一2一 细 胞分泌与内吞的 调 控机理 ：通过研究神经细胞离子通道、动

6、作电位和细胞分泌(胞吞) 的因果关系，揭示神经动作电位及其编码的分子机理，动作电位编码的信息内涵，及其编码与对神经递质分泌和心肌靶细胞调控的分子机制。因而这项研究有益于揭示神经信息传递及其神经对心脏调控的细胞机制。重点研究：1）影响动作电位编码的离子通道机制，重点研究钙离子通道、钠离子通道和K 通道、 SK 通道以及配体门控的 N 型 AChR 通道和 HCN 起搏离子通道对单个动作电位和动作电位编码的影响；2）影响神经递质分泌的动作电位机制。研究不同动作电位编码对分泌的调控；3）研究 DRG 神经元上动作电位诱导的钙离子非依赖的细胞分泌 CIVDS 的分子机理。试图揭示电压直接诱导分泌的关键

7、分子及其作用原理；4）电位编码对神经递质及其心脏靶子的调控。一3一 抑制性突触及其可塑性 ：在注重观察兴奋性突触传递的同时，应该更加注重研究抑制性突触传递的问题，突触的稳态一定是兴奋和抑制相互作用的结果。该课题将以 GABA 能和甘氨酸能抑制性突触 为对象，应用膜片钳电生理学、免疫组织化学和 Western blot、神 经细胞培养、 Ca2 成像、转基因小鼠等技术，在突触前递质释放（GABA 和甘氨酸）、 递质重摄取（GABA 转运体 GAT1）和突触后受体（GABA A 和甘氨酸受体）以及 Cl-稳态（KCC2 ）调节等不同层面上，研究抑制性突触及其可塑性在中枢神经信息处理中的作用，以及某

8、些疾 病 （如 脑 缺 血 、癫 痫 、疼 痛 和 药 物 成 瘾 等 ）条 件 下 抑 制 性 突 触 脱抑制对神经信息处理的影响， 以期阐明抑制性突触可塑性的机理以及抑制性突触与正常细胞活动和细胞功能的病理性改变的关系，并为临床上进行药物干预和治疗提供分子靶点和药理信息。一4一 神 经 信号的精确分析 计 算的机理 ：为了进一步澄清神经细胞突触动力学和神经信号精确分析计算过程的分子机理、及其在脑高级功能的程序编码中之作用，本项目将结合多学科的原理和技术（行为学、电生理学、 细胞影像学、分子生物学和数学物理建模），重点分析脑功能、神 经网 络和神经细胞突触动力学、信号精确分析计算过程与特定分

9、子的相关性。值得强调的是，在研究神经信号精确分析计算过程的细胞分子基础中，我们将以哺乳动物学习记忆细胞模型和视觉细胞动力学的研究为突破口。 科学 问题 ：1）探索与学习记忆行为相关的神经细胞和突触活动的动力学以及神经信号的精确分析计算过程，阐明其细胞学基础。2）利用分子生物学技术（转基因动物和 siRNA 基因沉默技术），分析鉴定与复杂行为、神经细胞和突触信号的分析计算过程相关的分子，阐明脑高级功能的分子机理。3）利用转基因动物的病理模型研究神经信号错误计算编码与脑功能疾病的分子机理。4）在研究脑功能相关信号的精确分析计算过程和脑疾病神经信号错误编码的细胞分子机理的基础上，研发并筛选增强脑高级

10、功能和防治功能性脑疾病的中西药化合物。（5） 视 网膜神 经 回路的信息 处 理 ： 应用免疫组化、共聚焦显微镜、细胞内记录、膜片钳记录、Ca 2 成像等技术，在不同层次标本上(灌流视网膜铺片、视网膜薄片、单个分离视网膜细胞、细胞膜片)，研究双极 细胞和神经节细胞的信息处理中具有重要意义的关键问题。从而对视网膜信号传递直通线上的两个关键神经元的活动的机制形成创新的理论认识。具体研究目标：1）确定视锥细胞终末的GABA 受体如何介导水平细胞向视锥的反馈，进而 调制双极细胞的活动；2）确定甘氨酸如何参与不同型双极细胞感受野的中心和周围反应；3）确定钠尿肽、褪黑激素对双极细胞、神经节细胞的调制及其机

11、制；4）对 Mller 细胞如何通过谷氨酸、GABA 转运体对递质的摄取和逆向释放以及由 Ca2+通道介导，对双极细胞、神 经节细胞活动的调制及其机制形成较深入的认识。一6一 果 蝇长时记忆 的分子机理 ：通过综合运用遗传筛选、行为检测、免疫组化、电生理、基因芯片、RNA 干扰等研究手段，确定几个 Notch 信号通路中参与长时程记忆形成的关键基因。在果蝇的长时程记忆形成过程中，将 Notch 过量表达后可易化果蝇长时记忆的形成；而将其突变后，可以抑制长时程记忆的形成。这说明 Notch 确实 参与了果蝇 学习记忆的过程。然而 Notch 在学习和记忆中的信号通路究竟是什么？Notch 在 发

12、育过程中的信号通路是不是它在学习和记忆中的信号通路？目前，关于这一方面的认识还不是很完善。因此，我 们将继续解决：1）通过对已知的突变体及筛选出来的突变体进行行为，生理，生化，免疫，分子，遗传学研究，从而确定哪一类 Notch 配体参与了长时程 记忆的形成；2）通过对已知的突变体进行行为学分析，结合基因芯片分析受行为影响及 Notch 调控的基因，确定参与长时程记忆形成的 Notch 下游的候选基因；3）用免疫组织化学方法，确定Notch 信号通路在突触 结 构可塑性中的作用。从而，验证我们所提出的假设：长时程记忆的形成也包含调控神经突触结构可塑性的 Notch 信号通路，最 终揭示长时程记忆

13、形成的分子细胞机理（7） 猴 长时记忆 的集群神 经 元 编码 ：大脑皮层相关区域的集群神经元是如何动态地组织起来，以实现记忆获得、巩固、储存和读 取，是本课题拟解决的关键科学问题。多通道神经元放电慢性记录技术的成熟和应用，为回答这一关键科学问题奠定了基础。主要研究内容：以条件性场景或声音恐惧记忆、慢性病理性疼痛记忆、空间和物体记忆为切入点，研究大 脑皮层相关区域（前扣带回、前 额叶背外侧部和颞下回）集群神经元在长时记忆获得、巩固、储存和读取过程中的动态活动模式。（8） 应 激行 为 与神 经 可塑性 稳态 ：注重比较急性应激因素与慢性应激因素对脑功能的动态平衡调控的影响效果，以往的研究大多偏

14、重于急性应激，如大鼠足底电刺激、高台恐怖刺激、吗啡成瘾后加高台恐怖刺激等，但是缺乏如在持 续几天至几个月的慢性病理性痛刺激（外周组织或神经损伤性痛）、慢性病理性痛刺激加精神恐怖刺激对动物负性习得性记忆行为（如条件位置回避性行为、条件位置偏爱性行为）和动物正性习得性记忆行为（如水迷宫实验）的效果有何差异？比较大脑皮层若干个与感觉认知和情绪相关脑区（大脑皮层 SI 区、SII 区、岛叶、扣带回、海马、杏仁核）的神经可塑性稳态问题的研究，特别在应激条件下找出可以引起 LTP 或 LTD 改变的因素，及其脑区之间的相互影响。该课题拟分为两个独立课题内容，一方面（由徐 林负责）以精神应激（如恐惧条件反射

15、、强迫游泳抑郁症、焦虑等）因素诱导的动物模型为主，采用 诸如在体电生理技术、 fMRI 技术、膜片钳全细胞记录技术等探讨精神因素应激是否兴奋某一些脑区（如海马）而抑制另一些脑区（如杏仁核），应激是否导致海马依赖的记忆损伤或记忆提取损伤？这种效应是否是长时程的？研究精神应激是否导致习得性 LTP？为寻找应激导致精神分裂症假说提供新证据。另一方面（由陈 军负责）以躯体应激（如外周组织或神经损伤造成的持续、慢性痛刺激）因素的动物模型为主，采用行为学（如条件位置回避性行为、条件位置偏爱性行为、水迷 宫等）、在体麻醉动物场电位或胞外记录技术、离体脑- 脊髓薄片单细胞胞外/全细胞膜片钳记录技术、离体脑-脊

16、髓薄片微电极阵列（8x8 MED64 道）技术和分子细胞生物学技术，研究：1）急慢性躯体应激因素是否引起诸如大脑皮层 SI 区、 SII 区、 岛叶、扣 带回、海马和杏仁核等脑核团发生细胞内在兴奋性或突触可塑性改变（LTP/LTD），如果有其 细胞分子机制是什么？比较研究脊髓和上述大脑皮质对躯体应激因素反应的异同，探讨药物治疗的新分子靶点和策略。2）大脑皮层 SI 区、SII 区、 岛叶、扣带回、海马和杏仁核等脑核团的稳态或稳态失调对动物慢性身体应激造成的行为改变，脊髓感觉与运动的作用方式是否有调控作用？最终是比较精神应激和躯体应激对脑结构和功能可塑性影响是否一致。分课题研究内容（一） 电压门 控离子通道的 调 控 ：1. 新型 BmNa 电压门控钠离子通道的完整基因编码 及其功能特征1.1. 选用节肢动物蝎神经索标本，克隆其 钠离子通道基因 (BmNa)，解读其完整的基因图谱编码特征。1.2. 构建 BmNa 的完整嵌合体质粒以及在爪蟾卵母细胞中的有效表达体系及其双电极记录技术平台1.3. 解析 BmNa