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1、糖皮质激素通过快速非基因组机制抑制中 性粒细胞性炎症及提高急性应同忌。I 土脞激耐受力 G l u c o c o r t i c o i dI n h i b i t sN e u t r o p h i l i cI n f l a m m a t i o n a n dI m p r o v e sA c u t eS t r e s sT o l e r a n c eb y R a p i d N Mechanism：ongenomlcM e c h a n i s m s 州 学科专业：航空、航天与航海医学 研究生姓名： 培养单位：培乔单位： 导师：亓 5 J ： 导师组： 刘磊
2、海军医学系 蒋春雷 王云霞 专巾业化 l 儿，、十 教授 副教授 教授 论文提交日期：2 0 1 2 年4 月 学位授予日期：2 0 1 2 年5 月 二 研究工作。 已经发表或 撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。 学蕊文作者鲐六f 磊 签字吼加眦月r 日 学位论文使用授权书声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印
3、或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：占扫1 磊 导师 签字日期：力弦牟舌月r 日 签字B 瓿：，揖乡R 厂彳 I I I 户 A 目录 中文摘要1 A B S T R A C T 4 缩写词表8 1 L j - 日U 吾1 0 第一部分 】L L 一 刖舌1 3 材料和方法1 7 实验结果2 6 讨 仑3 4 结论3 8 第二部分 1 L J L 日U 舀3 9 材料和方法4 1 实验结果4 7 讨 仑5 5 结 仑5 9 参考文献6 0 支献综述6 8 在学期间发表论文和参加科研工作情况说明7 9 致谢8 0 糖皮质激素通过快速非
4、基因组机制抑制中性粒细胞性炎症及提高急性应激耐受力 摘要 糖皮质激素( g l u c o c o r t i c o i d s ，G C s ) 是由肾上腺皮质分泌的一类甾体分子及其人 工合成类似物，它对机体的发育、生长、代谢以及免疫功能等起着重要调节作用，是 机体应激反应的枢纽，在应激反应和应激损伤中起关键性作用，也是临床上使用广泛 而疗效显著的抗炎、抗过敏和免疫抑制剂。G C s 除经典的基因组机制外，还存在着非 基因组作用机制。 G C s 非基因组机制常见于讨论大剂量冲击疗法的作用机制。在G C s 大剂量冲击 疗法时，G C s 剂量远高于饱和体内所有G C s 受体( g l
5、u c o c o r t i c o i d sr e c e p t o r ，G C R ) 所 需要的浓度，对此基因组机制是无法解释的。但是G C s 非基因组机制的分子作用靶 点仍有待进一步实验研究揭示。糖皮质激素大剂量冲击疗法是急性肺损伤、急性脊髓 损伤、C O P D 、急性活动期类风湿关节炎等众多急重症的特效治疗方法。这些G C s 大剂量冲击疗法的适应症中多数病理表现为中性粒细胞( n e u t r o p h i l ，又称多形核白 细胞，p o l y m o r p h o n u c l e a rl e u k o c y t e ，P M N ) 性炎症损伤，顾
6、名思义，其主要炎症细 胞为P M N 。P M N 是非常关键的固有免疫细胞，从其数量占人外周血白细胞总数的 5 0 7 0 可见一斑。细菌、病毒、异物等多种刺激均可以活化P M N 。活化的P M N 是 一把双刃剑，它通过吞噬、脱颗粒、呼吸爆发及分泌促炎细胞因子，既参与机体防御 功能和免疫反应，同时又可带来组织的继发性损伤，是多种疾病的主要炎症细胞。因 而，G C s 对P M N 作用的研究一直受到广泛的重视。我们课题组前期研究表明大剂量 G C s 具有快速抑制P M N 脱颗粒的效应，而抑制磷酸二酯酶4 ( P h o s p h o d i e s t e r a s e4 ， P
7、 D E 4 ) 可能是其作用机制之一。本课题研究第一部分在此基础上，以中性粒细胞 ( n e u t r o p h i l s ，P M N ) 为研究对象，建立了在体和离体炎症模型，以求在整体动物炎 症模型证明G C s 大剂量冲击疗法中存在非基因组作用；以偶联氨基酸新型G C s 进一 步验证G C s 快速抑制P M N 脱颗粒为非基因组效应；并通过研究胞内游离钙离子 ( C a z + i ) 、胞膜流动性、胞膜脂筏等关键靶点，以其进一步阐明G C s 抑制中性粒细 胞性炎症的非基因组分子机制。 G C s 非基因组机制的临床意义日趋明朗并逐渐被接受，但机体这一与生俱来的 重要的调
8、节机制不可能仅为临床用药准备着，必然有其重要的生理调节意义。目前， 学术界公认G C s 通过基因组机制发挥作用的时间一般至少需要3 0 分钟。故认为在急 性应激起始阶段交感肾上腺髓质轴发挥着重要作用，交感肾上腺髓质在应激时快速 分泌儿茶酚胺，具有兴奋心血管、呼吸系统、升高血糖等防御代偿意义。而许多急性 应激反应的初始阶段即有大量糖皮质激素分泌，并有多种生理生化指标产生快速改 变。G C s 分泌增多是应激反应中晟重要的环节。动物实验表明，摘除双侧肾上腺的动 第二军医大学博士学位论文 物只能在没有应激的状态下生存，轻微的有害刺激即可导致其死亡。但如仅去除肾上 腺髓质而保留肾上腺皮质，则动物的生
9、存能力增强。给摘除肾上腺的动物注射G C s ， 可使动物恢复抗损伤的能力。可见，机体调节应激反应离不开G C s ，故我们推测急性 应激早期即有G C s 非基因组机制参与调节，但是目前还缺乏有力实验依据。因此， 在本课题的第一部分，我们以去肾上腺小鼠急性负荷强迫游泳( A c u t eW e i g h t L o a d e d F o r c e dS w i m m i n g A W L F S ) 力竭应激模型，观察应激剂量G C s 对小鼠游泳力竭时间 的快速调节作用，并应用G C s 核受体拮抗剂R U 4 8 6 排除经典基因组机制调节作用。 在组织器官水平，应用病理切片
10、H E 染色和电镜检测了G C s 对主要靶器官骨骼肌力 竭损伤的快速保护作用。检测血糖、血乳酸、N O 、骨骼肌A T P 等重要生理和生化指 标。在细胞水平，利用小鼠骨骼肌C 2 C 1 2 细胞株分化成肌管细胞，以A C h 刺激肌管 细胞强直收缩模拟力竭运动，检测G C s 对肌管细胞葡萄糖摄取、N O 合成释放的影响。 探索G C s 在调节急性应激反应中的非基因组作用及其初步分子机制。 主要实验结果如下： 一、糖皮质激素通过快速非基因组机制抑制中性粒细胞性炎症： 1 大剂量甲强龙( O 0 4m g gb o d yW ti V ) 抑制了甲酰三肽( N - f o r m y l
11、 m e t h i o n y l - l e u c y l p h e n y l a l a n i n e ，f M L P ) 引发的小鼠急性全身性炎症反应血浆M P O 、乳铁蛋白等 中性粒细胞脱颗粒源性炎性介质释放。 2 偶联氨基酸新型G C s 可在其作用1 0 分钟内抑制P M N 脱颗粒。 3 大剂量G C s 在1 5 分钟内对P M N 无细胞毒性作用，反而具有保护作用。 4 G C s 加快f M L P 激发的P M N C E + 】i 升高快速恢复正常，并且不能被R U 4 8 6 、 C H X 阻断。 5 甲强龙( 1 0 - 41 0 弓M ) ，f M
12、 L P 自身均具有快速升高P M N 胞膜荧光偏振度，降 低P M N 胞膜流动性的作用。M P 与f M L P 同时作用下，P M N 微黏度较两者中任何一 个单独作用都显著降低。 6 甲强龙及偶联B S A 的皮质酮预处理可抑制f M L P 引发的P M N 胞膜脂筏呈多 点聚集现象，R U 4 8 6 、C H X 均不能阻断这一效应，但是以M 1 3 C D 破坏胞膜脂筏，对甲 强龙抑制P M N 脱颗粒效应无影响。 二、糖皮质激素通过快速非基因组机制提高急性负荷强迫游泳力竭应激耐受力： 1 利用去肾上腺小鼠急性负荷游泳力竭应激模型，发现G C s 在早期( 2 0 分钟内) 即
13、可以显著延长小鼠的游泳力竭时间，而G C s 受体拮抗剂R U 4 8 6 不能阻断G C s 的这 一早期效应。 2 在组织器官水平，组织病理观察：H E 染色结果显示负荷游泳力竭小鼠骨骼肌 2 糖皮质激素通过快速非基因组机制抑制中性粒细胞性炎症及提高急性应激耐受力 部分肌纤维断裂、溶解，G C s 能够在作用2 0 分钟内减轻充血和肌纤维的损伤。电镜 观察到负荷游泳力竭小鼠腓肠肌肌原纤维部分溶解、肌浆网空泡化，部分M 线及Z 线模糊消失、线粒体固缩、密度增高，而G C s 预处理组损伤不明显。 3 在整体动物水平，G C s 快速降低游泳力竭小鼠血浆N O 水平，N O S 抑制剂 L N
14、 A M E 单独或联用G C s 均可延长小鼠力竭时间。G C s 可快速抑制A C h 引起的肌管 细胞N O 释放，R U 4 8 6 不能阻断。G C s 可快速升高力竭游泳小鼠血糖和骨骼肌组织 A T P ，并不能被R U 4 8 6 阻断，但在细胞水平抑制骨骼肌细胞葡萄糖摄取。 结论： 以上结果表明： 1 大剂量G C s 具有体内外快速抑制P M N 脱颗粒的非基因组效应，可能是G C s 治疗急性肺损伤、急性脊髓损伤、C O P D 、R A 等许多中性粒细胞性炎症性疾病的重 要机制之一；G C s 促进f M L P 激发的P M N 升高快速恢复，可能是G C s 快速抑制P M N 脱颗粒的非基因组作用靶点之一；G C s 对P M N 胞膜脂筏、膜流动性的快速作用并非 G C s 快速抑制P M N 脱颗粒的作用靶点。 2 G C s 非基因组机制存在于急性应激反应这一生理进程中，应激时G C s 大量快 速分泌具有其非基因组机制的生理意义；G C s 一方面通过快速抑制N O 系统过度活化 升高骨骼肌组织A T P 并解除N O 对肌力的直接或间接抑制，另一方面通过抑制骨骼 肌等细胞摄取葡萄糖快速升高力竭游泳小鼠血糖途径提高机体对急性力竭应激反应 的
