《糖基化终末产物及probucol对大鼠心脏微血管内皮细胞enos脱偶联和内皮祖细胞的增殖、凋亡及管腔形成作用的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《糖基化终末产物及probucol对大鼠心脏微血管内皮细胞enos脱偶联和内皮祖细胞的增殖、凋亡及管腔形成作用的研究（95页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、糖基化终末产物及P r o b u c ol 对大鼠心脏 微血管内皮细胞e N O S 脱偶联和内皮祖细 胞的增殖、凋亡及管腔形成作用的研究 S t u d yo nt h eE f f e c to f A d v a n c e dG l y c a t i o n E n dP r o d u c t sa n dp r o b u c o li n e N o S u n c o u p l i n g P r o c e s so fC a r d i a c 】i c r o v a s c u l a rE n d o t h e l i a l C e l l sa n d p
2、 r o l i f i a t a t i o n 、p o p o t o s “ a n dt u b ef o r m a t i c p r o l i l a t a t i o na p o p o t o s t sa n t u D ef o r m a t i o n、 o fE P C s 博士研究生：成永霞 指导教师：杨向红 中国医科大学 沈阳i 1 0 0 0 1 ，中国 二零零九年五月 C a n d i d a t ef o rD o c t o rD e g r e e ：C h e n gY o n g x i a S u p e l w i s o r ：Y
3、 a n gX i a a g h o n g C h i n aM e d i c a lU n i v e r s i t yG r a d u a t eS c h o o l N o r t h2 n dR o a d9 2 ，H e p m gW a r d , S h e n y a n g11 0 0 0 1 ，C h i n a M a y , 2 0 0 9 f 煳嬲 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，
4、也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 釜筮霞日期：妞鱼生玺当三箩日 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在 攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离 校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师 为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国 、 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文
5、被查阅和借阅。学 校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩 印或其他手段保存论文。 论文作者签名： 凌基霞 指导教师签名：塑兰 一、摘要 目录 中文论著摘要1 英文论著摘要8 二、英文缩略语1 7 三、论文 论文一、糖基化终末产物对大鼠心脏微血管内皮细胞一氧化氮合酶脱偶联的影响 前言1 8月O 舌”“”“”“”“”“”“l 芍 材料与方法1 8 实验结果2 2 讨论一“2 8 结论一一”3 0 论文二、P K C N A D P H 氧化应激途径对糖基化终末产物引发心脏微血管内皮细胞一 氧化氮合酶脱偶联及p r o b u c o l 作用的研究 前言”3 1翮看
6、”“”“” 材料与方法3 1 实验结果3 7 讨论”5 1 结论”5 3 论文三、糖基化终末产物对大鼠骨髓来源内皮祖细胞增殖、凋亡和管腔形成的影 、 响及p r o b u c o l 的作用 前言“”一5 4翮看”“”一“”“”“”。b 4 材料与方法5 4 实验结果5 8 讨论”一”“6 5 结论”一”“”“”一”6 6 四、本研究创新性的自我评价6 7 五、参考文献? 6 8 六、附录 综述一、e N O S 脱偶联在糖尿病性心肌病中的作用7 2 综述二、氧化应激在E P C s 动员和功能中的作用8 1 在学期间科研成绩8 9 致谢“”一“9 0 个人简介9 l 中文论著摘要 糖基化终
7、末产物及p r o b u c o l 对大鼠心脏微血管内皮细 胞e N O S 脱偶联和内皮祖细胞的增殖、凋亡及管腔形 成作用的研究 刖吾 大量证据表明，体内糖基化终末产物( A d v a n c e dg l y c a t o ne n d p r o d u c t s ，A G E s ) 的 不断累积与心血管疾病的发生发展关系密切。A G E s 与A G E 受体( r e c e p t o rf o r A G E ，R A G E ) 相互作用可诱导活性氧簇( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，R O S ) 的产生，从而
8、引发氧化应激。 有证据表明，A G E s 诱导的氧化应激是糖尿病性心肌病重要的促发因素。而现 在的研究认为，糖尿病性心肌病实质是一种微血管病变，更为重要的发病机制是 微血管舒张功能障碍而引发的组织缺血。N O 是保持血管组织舒张功能的重要因 子，在糖尿病状态下，血管组织中e N O S 脱偶联是导致N O 生成减少的主要机制， 致使血管组织舒张功能受损、组织缺血而引发一系列疾病。 现在的观点认为，组织中氧化应激的爆发是e N O S 脱偶联发生的最主要原因。 关于其具体机制，有研究者认为依赖P K C 的N A D P H 氧化酶激活在介导糖尿病患者 内皮细胞氧化应激发生和并发症形成中起重要
9、作用。W a r b o y sC M 最新研究发现， A G E s 可以通过R A G E 激活P K C ，从而使肾脏微血管内皮细胞内的N A D P H 氧化酶表 达增加。而N A D P H 氧化酶使细胞内I 的S 增加，R o S 又能导致e ；N O S 脱偶联的发生， 进而引起内皮细胞功能紊乱。 然而，糖尿病性心肌病作为一种心脏微血管病变，A G E s 是否引起心脏微血管 内皮细胞内的R O S 产生增加从而引起e N O S 脱偶联及其分子机制仍然不清晰。以往 的实验研究采用大血管内皮细胞功能紊乱来阐述糖尿病心肌病的发病机制，这种 准确性尚存在质疑。因此，本实验将心脏微血管
10、内皮细胞作为研究主体，观察A G E s 作用下心脏微血管内皮细胞内是否出现e N O S 脱偶联现象以及P K C N A D P H 氧化应 激途径在其中的作用。 另外，现在的研究认为，普罗布考( p r o b u c 0 1 ) 很可能通过对抗氧化应激损伤 的机制，显著提高内皮依赖性的血管舒张功能，改善内皮功能障碍，因此在治疗 糖尿病微血管并发症领域有广阔的前景。本实验同时观察普罗布考能否通过抑制 e N O S 脱偶联的机制达到缓解内皮细胞功能紊乱、预防糖尿病性心肌病的作用。 大量的证据表明，E P C s 构成重要的内生系统以保持血管内皮的完整性和血管 内环境的稳定，同时E P C
11、 s 数量的减少也可以预测心血管疾病的发生。体外实验和 临床研究显示，氧化应激也会影响E P C s 动员，从而破坏血管内皮的完整和内环境 的稳定。对氧化应激导致E P C s 数量和功能异常的机制的了解，将会为理解心血管 疾病的发病机制提供独特的视角，并为临床治疗提供新的靶点。因此，本实验要 将E P C s 作为研究主体，观察A G E s 对其增殖、凋亡和管腔形成能力的影响，另外观 察普罗布考是否具有保护E P C s 的作用。 实验方法 一、大鼠心脏微血管内皮细胞原代培养及鉴定 2 0 3 0 9W i s t a r 胎大鼠取心脏组织，剪碎，0 1 I I 型胶原酶和0 0 5 胰蛋
12、白酶 消化培养法进行原代培养。采用第3 5 代细胞进行实验。内皮细胞鉴定：荧光显 微镜下观察抗因子抗体结合情况。 二、E P C s 原代培养及鉴定 采用F i c o l l 密度梯度离心法结合差速贴壁筛选法从大鼠骨髓分离E P C s ；收集 培养5 d 的E P C s ，用激光共聚焦显微镜观察，A C l 3 3 和v W F 双染阳性细胞为正在 分化的E P C s 。 三、A G E s 的制备 2 0 9 LB S A 与5 0 0 m m o l L 葡萄糖溶于P H 7 4P B S 中混匀，并加入终浓度为 0 5 m m o l L 的E D T A ，室温放置过夜。0 2
13、 p m 滤器过滤，灭菌封口后放置3 7 避光 孵育9 0 d 取出，荧光光谱扫描检测制备的B S A - A G E s 。实验前用P H 7 4P B S 透析 去除未结合的葡萄糖及E D T A 。 2 四、实验分组 对照组、A G E s ( 5 0 m g L ，1 0 0 m g L , 2 0 0 m g L ) 分别作用( 0 h , 6 h , 1 2 h , 2 4 h ) 组、 A G E s l 0 0 m g L + L Y 3 3 5 3 1 ( 2 5 p M ，5 1 x M ，1 0 I - t M ) 组、A G E s l 0 0 m g L + D P I ( 2 5 1 x M ，5 p M ， I O p M ) 组和A G E s l 0 0 m g L + p r o b u e o l ( 5 I I t M ，1 0 1 x M ，2 0 p M ) 组。对照组加无血清培养液 培养。 五、R o S 测定 采用2 ，7 二氯荧光黄双乙酸盐( D C F H D A ) 荧光染色检测R O S 。D C F H D A 本 身没有荧光，但可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，细胞内的R O S 可以氧化无
