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1、第22章 基因结构与功能 分析技术,蒋小英 jiangxy 生物化学与分子生物学系 西 安 交 通 大 学 医 学 部 基 础 医 学 院,主要内容： 第一节 基因结构分析技术 第二节 基因表达产物分析技术 第三节 基因的生物学功能鉴定技术,第一节 基因结构分析技术,一 基因一级结构解析技术 二 基因转录起始点分析技术 三 基因启动子结构分析技术 四 基因编码序列分析技术 五 基因拷贝数分析技术,一 基因一级结构解析技术,基因一级结构:脱氧核苷酸的排列顺序。,基因一级结构的分析: DNA测序 DNA sequencing,DNA测序技术的发展,1. 最初在20世纪60年代，部分酶解法测RNA，
2、费时费力。 2. 1977年英国F.Sanger创建了双脱氧法， 同年美国A.Maxam和W.Gilbert创立了化学降解法。3人获得1979年诺贝尔化学奖。 3. 1986年，L.M.Smith用4色荧光代替放射性核素标记。 4. Taq DNA聚合酶应用于双脱氧法，建立了PCR测序。 5. 1987年， DNA序列自动测定仪问世。是双脱氧法，荧光标记法和激光检测法的结合。 第一代测序技术：自动激光荧光DNA测序 第二代测序技术：循环芯片测序 第三代测序技术 ：单分子测序,Sanger双脱氧终止法 (chain-terminator method),单链DNA模板指导合成其互补链时，聚合酶将
3、dNTP加到引物的3-OH末端使其不断延伸，如果加入双脱氧三磷酸核苷（ddNTP）,由于ddNTP的3位置上缺少一个羟基，不能同后续dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种具有相同5-引物端和以ddNMP残基为3端的一系列长短不一片段的混合物。聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，读取DNA序列。,双脱氧三磷酸核苷（ddNTP）,双脱氧终止法测序反应体系：,DNA聚合酶 单链DNA模板 带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物 Mg离子 4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP) 4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP),测序反应的种类, 引物标记法 (D
4、ye primer reactions) 终止物标记法 (Dye terminator reactions), 引物标记法, 终止物标记法,Maxam-Gilbert化学修饰法 (chemical cleavage method),末端标记的DNA用专一性化学试剂进行特异降解。 第一步，对特定碱基（特定类型的碱基）化学修饰； 第二步，修饰碱基从糖环上脱落，修饰碱基5和3的磷酸二酯键断裂； 第三步，电泳，比较G、A+G、C+T、C各个泳道，可从测序凝胶的放射自显影片上读取DNA序列。,DNA化学裂解反应体系,15,（二）全自动激光荧光DNA测序技术,1. 四色荧光法： 四种不同荧光染料标记同一引
5、物或4种ddNTP，一个样品的4个反应产物在一个泳道内电泳。 2. 单色荧光法： 单一荧光染料标记引物5-端或dNTP，一个样品的四个反应必须分别进行，产物须在四个泳道内电泳。,第一代测序技术：原理基于Sanger双脱氧法,（三）焦磷酸测序是基于发光法测定焦磷酸的测序技术,焦磷酸测序技术操作简单，结果准确可靠，可应用于单核苷酸多态性位点（SNP）分析、等位基因频率测定、细菌和病毒等微生物的分型鉴定、CpG甲基化分析、扫描与疾病相关基因序列中的突变点等领域。该方法的测序长度一般短于Sanger法。,dNDP,（四）循环芯片测序被称为第二代测序技术,循环芯片测序（cyclic-array sequ
6、encing）, 可实现大规模并行化分析 不需电泳，设备易于微型化 样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本,优势：,技术平台： 454测序、Solexa测序（Illumina测序）、SOLiD测序等。,基本流程：, 将基因组DNA随机切割成为小片段DNA； 在小片段DNA末端连上接头，变性得到单链模板文库； 将带接头的单链小片段DNA文库固定于固体表面； 对固定片段进行克隆扩增，从而制成polony芯片。 针对芯片上的DNA，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到DNA链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。,（五）单分子测序技术被称为第三代测序技术,针对单分子进行序列分
7、析，无须扩增 主要策略：, 通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序，如单分子实时技术（single molecule real time technology，SMRT）； 利用DNA聚合酶在DNA合成时的天然化学方式来实现单分子测序； 直接读取单分子DNA序列信息。,主要内容： 一)、基因转录起始点的序列特征 二)、基因转录起始点的序列分析,二 基因转录起始点分析技术,一、基因转录起始点的序列特征,1. 真核基因及其调控元件,II 型启动子的TSS： 没有明确的保守序列 有一种趋势，即mRNA 的第一个碱基是A，其侧翼碱基倾向于是嘧啶 与mRNA第一个碱基对应的位置标记为+ 1区
8、-3 +5区域被称作起始子 (initiator),2. 转录起始点（transcription start site, TSS）,Py2CAPy5,二、基因转录起始点的序列分析,思考： 转录起始点 (TSS)位于基因编码序列的5端 基因编码区是指体现在多肽链中的核苷酸序列 多肽链是以mRNA为模板经翻译合成的,因此， 分析鉴定TSS的方法都是以cDNA为切入点,1. cDNA克隆测序,AAAAAn,AAAAAn,mRNA,反转录酶,AAAAAn,Oligo (dT)15-18,cDNA第一链,CCCCC,cDNA第一链,nCCCC,nGGGG,cDNA第二链,克隆扩增，5端测序分析,反转录酶
9、的末端转移酶活性 Oligo dc,与线性载体相连接,用寡核苷酸替代mRNA的5端帽结构以及发光标记巢氏PCR,5-p 帽,mRNA,牛小肠磷酸酶 (CIP),5-帽,烟草酸焦磷酸酶 (TAP),5-,将5-RACE 加到脱帽RNA分子上,5-RACE adaptor (寡核苷酸),反转录酶 10nt 随机引物,2. 5- cDNA末端快速扩增技术 (5- rapid amplification of cDNA end，RACE),5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,长短不同的cDNA,随机引物,用10nt随机
10、引物与5-RACE引物进行PCR扩增,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,5-RACE adaptor,PCR产物,随机引物,以5-RACE引物和基因特异性反向引物进行巢氏PCR,5-RACE adaptor,以5-RACE发光标记引物对PCR混合物直接进行一次性测序,分析基因转录起始点,用5-cDNA末端快速扩增技术鉴定TSS,3.连续分析基因转录起始点,转录本5 端引入特殊的II型限制性核酸内切酶识别位点，5 端短片段连接产物一次测序分析多个基因转录起始点。 主要有两种方法： 5 端连续分析基因表达（5 -end serial anal
11、ysis of gene expression, 5 SAGE） 帽分析基因表达（cap analysis gene expression, CAGE）,将MmeI酶切位点引入cDNA5端，酶切和连接获得不同短片段连接产物，测序获得序列信息。,MmeI: 是一种特殊的II型限制性核酸内切酶 识别的序列不是回文结构，而是不对称的DNA序列5-TCCRAC-3（R代表G或A） 在识别位点下游18-20碱基处切开双链DNA,5 端连续分析基因表达（5 SAGE）,Gppp,AAAAAAAAn,mRNA,用BAP和TAP处理,AAAAAAAAn,p,在RNA的5端加上寡核苷酸帽,AAAAAAAAn,X
12、hoI,MmeI,反转录酶,RT,AAAAAAAAn,cDNA,PCR,Biotin-标记引物,随机引物,Biotin,MmeI,酶切消化,20 mer,亲和素,用亲和素-生物素，可以将5-端片段与其他片段分离开,20 mer,连接,20 mer,PCR扩增,XhoI,酶切消化,自身连接,串联体,测序分析,3.用数据库搜索TSS,利用对寡核苷酸帽法构建的全长cDNA文库5-末端测序所得的数据信息建立了一个TSS数据库（database of transcription start sites，DBTSS），并在此基础上，通过将寡核苷酸帽法和大量平行测序技术相结合开发了一种TSS测序法，从而实现
13、了一次测试可产生1107 个TSS的数据。,三 基因启动子结构分析技术,主要内容： 一、启动子的结构分析 二、启动子的功能分析,启动子（promoter） 是一段能被蛋白质识别的、参与特定基因转录调控的DNA序列 II型启动子通常位于结构基因的上游 共通序列(consensus sequence)是其特征性序列,共通序列和启动子所处的位置是研究启动子的重要线索,共通序列,原核基因的共通序列：-10区： -35区： 真核基因的共通序列： 真核基因启动子在-50区域附近（大约5%30%基因启动子在-25-30区域）有TATA box（TATAAA序列）,TATAAT,TTGACA,一、启动子的结构
14、分析,主要方法： 利用PCR技术克隆启动子 利用核酸-蛋白质相互作用方法研究启动子 生物信息学预测启动子,（一）利用PCR技术克隆启动子,特异性基因序列,基因上游序列,基因组DNA,根据基因序列合成一条反向引物 正向引物用随机引物,PCR扩增,随机引物,特异引物,克隆及测序分析,注意： 真核基因有内含子，应该根据mRNA序列设计特异性引物 特异性引物尽可能靠近基因的5端,1. 根据已知基因序列直接进行PCR扩增,2. 利用TSS钓取启动子,AAAAAAn,Cap 5-,mRNA,反转录,AAAAAAn,TTTTTTn,cDNA,插入载体，克隆扩增,Cap 5-,以基因特异引物与载体引物配对,P
15、CR扩增,5-,测序分析基因转录起始点序列,以TSS序列为引物，基因组序列为模板，与随机引物配对进行TSS上游序列的PCR扩增,3. 利用环状PCR钓取启动子,基因组DNA,酶切消化,基因组DNA片段,直接环化连接,加上接头后环化连接,根据基因上游序列设计一对反向互补引物,PCR扩增,根据接头序列设计引物,PCR扩增,克隆 测序分析,克隆 测序分析,加接头环化PCR不依赖特异基因序列 可用于筛选启动子,接头,（二）利用核酸-蛋白质互作方法研究启动子,主要方法： 足迹法（酶足迹法，化学足迹法） 电泳迁移率变动实验（EMSA） 染色体免疫沉淀（ChIP）,1. 用足迹法研究启动子,足迹法（Footprinting） （酶足迹法，化学足迹法） 利用DNA电泳条带连续性中断的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA区域,基本流程：,DNA与蛋白质相互作用,切割DNA,凝胶电泳,分析电泳图谱,（1）酶足迹法 (Enzymatic footprinting),DNase I足迹法 (DNase I footprinting),核酸外切酶III足迹法 (Exonucleoase III footprinting),（2）化学足迹法 (Chemical footprinting),DNase I 足迹法,dsDNA,单链末端标记,DNA结合蛋白,
