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1、,一、原核生物与真核生物的基因结构,1、原核生物基因结构,编码区,非编码区,非编码区,编码区上游,编码区下游,编码蛋白质,调控遗传信息的表达,（调控程序）,AATGTGCACGTAGTTAGTTACACGTGCATCAATC,启动子,终止子,（1）编码区和非编码区,能编码蛋白质的区段叫做编码区； 不能编码蛋白质的区段叫做非编码区， 在非编码区上有调控遗传信息表达的核苷酸序列,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,ATGTGCACGTAGTTA,TACACGTGCATCAAT,RNA聚合酶,AUGUGCACGUAGUUA,启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序
2、列。没有启动子，基因就不能转录。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,（2）启动子、RNA聚合酶、终止子,编码区,非编码区,非编码区,（能编码蛋白质）,启动子,终止子,外显子,内含子,编码蛋白质,（不能编码蛋白质）,2、真核生物的基因结构,（1）外显子和内含子,外显子能编码蛋白质，内含子不能编码蛋白质。,（2）非编码区和非编码序列,非编码序列包括非编码区和编码区的内含子,原核细胞的基因结构,真核细胞的基因结构,相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区
3、和具有调控作用的非编码区构成。不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。,二、基因工程的基本操作程序： 阅读教材P8-12，回答下列相关问题：,1、基因工程的基本操作流程图：,1、从基因文库中直接获取:,（1）基因文库的概念：见P9,（2）基因文库的分类:(按外源DNA片段的来源分类),基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,（3）建立基因文库的目的：,在未知基因序列的情况下，便于寻找并获得所需的大量的目的基因。,（4）基因文库的构建方法：,直接分离法-基因组文库 反转录法-cDNA,（一）目的基因
4、的获取,生物材料 分离DNA DNA片段基因组文库 分离MRNA cDNA cDNA文库,从基因文库 中获取,限制酶切割,反转录, 利用PCR技术扩增,化学方法人工合成,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,基因文库的构建方法之一：,直接分离法(鸟枪法) -原核生物的基因组文库,用限制酶切成许多片断,在细胞质中将mRNA分离并加入反转录酶,合成第二条DNA链,真核细胞的基因,在细胞核内转录,原核细胞的基因:,在细胞质内转录,基因文库的构建方法之二：,反转录法：-主要是真核生物的cDNA,mRNA,DNA单链,cD
5、NA,基因文库的构建方法,2019/11/2,9,生物材料 分离DNA DNA片段基因组文库 分离MRNA cDNA cDNA文库,从基因文库 中获取,限制酶切割,反转录, 利用PCR技术扩增,化学方法人工合成,2、利用PCR技术扩增目的基因,四种脱氧核苷酸,一对引物：,热稳定DNA聚合酶,模板DNA( 需含有目的基因 ),（4）条件：,一对寡核苷酸序列，与目的基因的起始段互补,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物,（5）前提：,加热,（3）过程：,（6）结果：,指数,2n,（7）PCR技术扩增与DNA复制的比较：,DNA复制（碱基互补配对原则）,以_方式扩增，即_扩增（n为
6、扩增循环的次数）,是一项在已知特定DNA片段的碱基序列情况下，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。,（4）过程：,高温变性（解旋为单链）,低温退火（引物与单链互补序列结合）,适温延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链）,重复循环,PCR(多聚酶链式反应),【比较】PCR技术和DNA的复制,目的基因的mRNA,单链DNA,双链DNA (即目的基因),反转录,合成,1）反转录法：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：（化学合成仪）,3、人工合成的目的基因,1. 构建表达载体的目
7、的：,IMN,2. 一个表达载体组成：,使目的基因在受体细胞中稳定存在并 遗传给子代。 同时使目的基因能表达和发挥作用。,（二）基因表达载体的构建 -基因工程的核心,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,（1）启动子：是一段有特殊结构的_，位于基因的_，是_识别和结合的部位，能驱动基因转录出_，最终获得所需的_。 （2）终止子：也是一段有特殊结构的_ ，位于基因的_。 （3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中_，从而将含有_的细胞筛选出来。常用的标记基因是_。 （4）复制原点：复制的起点,3、基因表达载体的构建的过程：,（三）将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,导入植物
8、细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca2+处理法,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,受体细胞 方法 过程,受体细胞 方法 过程,受体细胞 方法 过程,1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法,A.易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力 B.Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上,过程： 优点:,（2）基因枪法 （3）花粉管通道法,农杆菌特点： 受体细胞：,目的基因插人Ti质粒的 上转入农杆菌导入植物细胞目的基因整合到植物细胞_上目的基
9、因的遗传特性得以稳定维持和表达。,植物体细胞,2、将目的基因导入动物细胞 受体细胞： 方法： 程序：,显微注射法,-受精卵,将含有目的基因的表达载体提纯取卵获得受精卵显微注射早期胚胎培养胚胎移植发育成为具有新性状的动物,3、将目的基因导入微生物细胞 受体细胞： 方法： 过程：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,原核细胞或酵母菌，其特点是：单细胞、繁殖速度快、遗传物质少，获得目的基因产物多。,- Ca2+处理法,思考： 1、导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？怎么筛选出含有目的基因的细胞？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少
10、；用标记基因筛选。,导入,含有氨苄青霉素 的完全培养基,不能存活,Ca2+ 处理,检测,1、培养不具有氨苄青霉素抗性基因的农杆菌,具有氨苄青霉素抗性基因的农杆菌,完全培养基,含有氨苄青霉素 的完全培养基,培养,培养d,2、把含有氨苄青霉素抗性基因的表达载体导入,3、进行检测,存活,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据： - 是标记基因是否表达,（四）目的基因的检测与鉴定：,思考： 目的基因导入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,1、分子水平的检测:,转基因生物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,基因探针：,放
11、射性同位素等标记的DNA分子,-DNA分子杂交技术,变性,变性,变性,-DNA-RNA分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物 的mRNA,14N,14N,15N,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗原-抗体分子杂交技术,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,2. 个体生物学水平的鉴定,-抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,
