《秃疮花提取物对红细胞氧化性溶血的抑制作用及其抗氧化机理的探讨》由会员分享，可在线阅读，更多相关《秃疮花提取物对红细胞氧化性溶血的抑制作用及其抗氧化机理的探讨（44页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、兰州大学 硕士学位论文 秃疮花提取物对红细胞氧化性溶血的抑制作用及其抗氧化机理 的探讨 姓名：赵祁 申请学位级别：硕士 专业：生物学、生物物理学 指导教师：王勤 20030501 摘要 目的：探讨秃疮花提取物( D L F ) 对鼠红细胞氧化性溶血的影响及其机理。方 法：以H 2 0 ：诱导体外鼠红细胞发生氧化性溶血，以乙酰苯肼( A P H ) 引发小鼠 体内溶血性贫血，观察不同剂量D L F 对鼠红细胞溶血率，细胞形态，小鼠体内 的红细胞、白细胞数量，血红蛋白含量，血浆M D A 含量，红细胞中活性氧 ( R O S ) 生成量，红细胞内各种抗氧化酶活性，血浆总抗氧化力，以及红细胞 C R
2、 l 数量的改变来评价细胞受损的程度，并对其作用机理进行分析。结果：体 外D L F 对H 2 0 ：诱导的鼠红细胞溶血的抑制率可达7 8 ( P ，壤培C E L L D Y N l 4 0 0 E X 全秘动盘球计数仅( 美重穗培公司 ， 7 2 2 栅栏式分光光度计( 上海第三分析仪器厂) ，B H - 2 型捆差显撒镜 ( O l y m p u s ) ，3 5 5 0 鳌酶联检测仪( B I o - R 纳公司) 。 2 方法 2 1 体外实验。D L F 对H 舰诱导的鼠红细胞氧化性溶血的影响 2 + i 1 毅健康小鼠眼眶赧( 2 0 U m 1 4 肝素钠抗凝) ，用0 9
3、N a C l 溶液洗涤 3 次，制成0 5 的红细胞懋液，加入H 舷( H 。如终浓度为l O O m m o l L ) ，器分 8 剐加入0 2 m 浓度依次为1 0 0 、2 0 0 、3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 r a g m l ”的D 1 。F 溶 波，3 7 4 C 辉枣，依6 0 ，1 2 0 ，1 8 0 ，2 4 0 r a i n 分鲢取出，等量生残盐水稀释， 2 5 0 0 r m i n 。离心l O m i n ，取上清于4 1 5 n m 处测定A 值。将对照缎的A 值定义 为1 0 0 滚斑，诗冀溶盘趱菠。实验重复三次。“。 2 1 2 扫描电镜观
4、察红细胞形态”，红细胞处理同上，3 7 。C 孵育6 0 m i n 后 鞭出，雳2 潞茂= 醛固定3 0 r a i n ，瘸P B S 漂洗三次，每浚5 m i n ，薅用0 1 锇 酸固定1 0m i n ，同样用P B S 漂洗。继以l O 、2 0 、3 5 、5 0 、7 0 、8 3 、 l O O 叔丁蘸梯度脱水，每级1 5 m i n ，C O 。临界点干燥和磺镀金属膜，用扫描电 镜在2 0K V 下观察并照相。 2 2 体内实验，D L F 对乙酰苯肼引发的小鼠溶血性贫血的影响 2 2 。l 实验动物的处壤及溶盘热焚盎动物模型瓣建立8 。”。 选用健康小鼠5 6 只，随机分
5、为七组，每组8 只。分组如下，正常对照 缀( 0 。9 x a C l 溶滚l O m l k g 。d 。) ；模溪对照缀( 0 9 N a C l 溶液 l O m l k g 。d 1 ) ；为D L F 防护组，剂爨依次为1 9 k g d 、 1 + 5 9 - k g d 、2 9 k g 。d 、3 9 k g d 、4 9 k g - d 。各缀均于每同上 午定时进行腹腔注射( i p ) ，连续注射l O d ，除正常对照组外，其余各组皆于绘 药第一、第四、第七天下午i pA P I t 生理舷水溶液，首次剂量2 0 0 m g k g 一，后 联次剂量减半，建立溶壶悭贫盘动
6、物模型。 2 2 2D L F 对小鼠体内红细胞、臼细胞数目和血红蛋白含量的影响嘲 对镶撼2 。2 。l 处理遘豹各缝，l 、藏羧莛取盘( 3 0 笺E D T A 二舞蕊凝) ，盘球诗 数仪下测定红细胞、白细胞数目和庇红蛋臼含量。实验重复三次。 2 。2 3D L F 对夺虢红缨藏静形态学影嫡 对依据2 2 1 处理避的各缎小鼠眼眶取血( 2 0 U m l 。肝索钠抗凝) ， 0 9 N a c l 溶液洗搽3 次，制成1 红细胞懋液，p H 7 4 ，相夔显微镜下观察、照 相。实验薰复三次 9 2 2 。4D L F 对，l 、鬣盘浆褥二醛含囊豹影响。“”3 小鼠处理取m 同2 2 3
7、，取做浆0 2 m l ，依次加入8 I S D S 溶液0 2 m l ， 2 0 醋酸缓冲液( p H 3 5 ) 1 5 m l ，I T B A 溶液1 5 m l ，蒸馏水l m l ，充分混匀， 誉于8 0 。c 9 5 。C 下水浴4 0 至6 0 m in ，冷却，3 0 0 0 r m i n 。离心1 5 m i n ，取上清 液在5 3 2 n m 处测定A 值。实验重簸三次。 2 ，2 5D L F 对小鼠红缨腿武活性裁生成麓的影嗡 小鼠处理取珈同2 2 3 ，洗涤后取致细胞依攀建平法“2 3 破红细胞，制成溶 _ 敷滚，势菝试裁众方法遴行梭测，铡定劳诗冀夺鬣盔绸藏内活
8、纛氧生战嚣。 实验重复三次。 2 2 6D L F 对小鬣红缁稳蠢菝氧纯酶活住酶影嫡融“删 小鼠处理取m 同2 2 3 。洗涤后取红细胞依试剂盒方法进行梭测，矜剐测 定鬣红细簸内S O D 活性，C A T 活性，G S H P x 活性，G R 活性，G - 6 - P D 活性。实 验重复三次。 2 2 7D L F 对小鼠血浆总抗氧化力的影响 小鼠处理取血霹2 。2 。3 ，取擞浆锿试剂鑫方法送毒亍捡溅，溅定著诗算小氯 血浆总抗氯化力。实验重复三次。 2 2 。8D L F 霹小鬣程缨魏C R l ( e 南受俸) 数塞豹影豌”嘲 小鼠处理取觑同2 2 3 ，分离红细胞，用p H 7 4
9、 ，0 0 t m o l LP B S 洗涤两 次，取溢积红缨稳1 0 1 t l ，翱5 m lp n 7 4 ，0 5 m o l LT r i s - H C l 缓冲液，宣温 2 小时，使红细胞溶解，离心后用T r i s H C l 缓冲波洗沉积的红细胞膜一次。 将O 1 9 LC o n A l 0 0 1 l l 加入反应板孔中。3 7 。C2 0 m i n ；按常法洗三次，加入 l ：1 0 0 稀释的待检缎缨胞膜1 0 0 9 l ，3 7 4 C 过夜；期O 。0 5 戊二醛1 0 0 塾I ，3 7 C 3 0 m i r a 洗后用小牛血清封闭，3 7 。Cl h
10、洗后加豚鼠血清( 1 ：6 0 ) 1 0 0 1 1 1 ，3 7 。C l h ；洗爱鸯耩H R P 捷C 3 1 0 0 转1 ，3 7 。el h ：浚嚣趣j 蓑物溶滚( T M B 一氆0 2 ) 显魏。 终止反应后于酶联检测仪4 9 0 n m 测吸光度( A ) 值。取复孔值。将对照组的A 值定义为1 0 0 ，得出红细胞C R I 数量指标。实验重复三次。 2 2 9 数据处理 结果以i s 表示，两组均数比较采用t 检验。体外实验采用给药组与对 照组比较，成组t 一检验：体内实验采用给药组、正常对照组与模型对照组比 较，成组t 一检验( 计算由m i c r o s o f
11、t e x c e l 处理) 。 结果 1 D L F 对体外H ：O ! 诱导的红细胞氧化性溶血的抑制作用与时效、量效关系 如图l 所示，鼠红细胞与H ：0 。在3 7 下孵育6 0 m i n 后，可观察到明显而 迅速的溶血，溶血程度随着时间推移越来越高，孵育1 8 0 m i n 后，红细胞完全 近于溶血，溶血曲线趋于平缓；而加入不同浓度D L F 均能显著地降低红细胞的 溶血率，减缓溶血速度，当D L F 为2 0 0 m g m l 。1 时效果最为明显。 1 2 l O 8 O 6 0 4 O 2 6 01 2 01 8 02 4 0 F i 9 1 T i m e r e s
12、p o n s e c u r v eo ft h ee f f e c to fD L Fo no x i d a t i v eh e m o l y s i so f m o u s ee r y t h r o c y t e si n d u c e db y 如0 2n = 5 ，i S C o n t r o li p O 9 N a c l ， D L F J = O m g m 1 1 D L F = I O O m g m 1 1 D L F = 1 5 0 m g m l D L F = 2 0 0 m g m l1 。 如图1 所示，正常对照组于3 7 “ C 下孵育6
13、 0 m i n 后，H 2 0 ：诱导的红细胞氧化 性溶血即趋于完全，图2 则说明此时D L F 对H 。0 ：诱导的红细胞氧化性溶血的影 响及量效关系。当D L F 剂量为2 0 0 m g m l 。1 时，其溶血程度为对照组的 2 l _ 9 ，而浓度为5 0 m g m l 。4 0 0 m g m 1 1 时，D L F 对H 2 0 z 诱导的鼠红细胞氧 化性溶血均有显著的抑制效果，最佳剂量为2 0 0 m g m l 。 F i 9 2 - I n f l u e n c e so fD L Fo nh e m o l y s i so fm o u s ee r y t h
14、r o e y t e si n d u c e db yH 2 0 2a L 3 7 “ Cf o r6 0 m i n n = 5 ，x s N o t e ：v sc o n t r o l ( D L FO m g m l 。) ，u n p a i r e dt t e s t + p 0 0 5 ，”p O O l ， + + p O 0 0 1 2 体外实验D L F 对小鼠红细胞的形态影响 F i 9 3 M i c r o g r a p h so fm o u s ee r y t h r o c y t e su n d e rs c a n n i n ge l e c
15、 t r o nm i c r o s c o p e A ：N o n n o le r y t h r o c y t e ( D L F ，1 0 0m g m l1 ) B ：D a m a g e de r y t h r o c y t e ( D L F 3 0 0m g m l 。1 ) C ：C o n t r o l ( D L F 0m g m l 一1 ) D ：D L F ( 0m g m l 。) E ：D L F ( 1 0 0m g m l 。1 ) F ：D L F ( 2 0 0m g m 1 1 ) G ：D L F ( 2 0 0m g m l 一1 )
16、 H ：D L F ( 3 0 0m g m 1 1 ) 如图3 所示，与H ：O ：作用后，各组红细胞均受到程度不同的筑化损伤，表 璜勾绍稳貘党游发降低，膜表委爨嚣凸越秘斑获物，部分红细稳鞠鳃，释放穗 内岔物，在显微镜视野下呈现大片的絮状物质，其中对照组( D L F 浓度 O m ；m l 。) 受损鬣为羁显。丽吾D L F 保护组的红纲胞均受到一定酾保护，细胞 形态好于对照组，絮状物质较少，当D L F 浓度为2 0 0 m g m 1 1 时保护作用最为 鞠显，视搿中的巍细胞多清晰可辨，表面光滑，形态完整。 3 ，D L F 对小鬣体内红细胞、自缅徽数目和血红蛋囱含量的影响 如表1 所示，模型
