《2012级研究生生第六章--体外放射分析2012-11-17》由会员分享，可在线阅读，更多相关《2012级研究生生第六章--体外放射分析2012-11-17（120页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、放射性 核素标记物,被测物(antigen),特异结合试剂： 抗体(antibody) 特异结合球蛋白 受体蛋白 酶、微生物,竞争性 结合,被测物,标记的特异 结合试剂 （抗体）,非竞争性 结合,Non-competitive binding,RIA (Radioimmunoassay),要求： 掌握原理 把握特点 熟悉设计思想 了解计算方法,第四章 体外放射分析 第一节 放射免疫分析,131I-胰岛素,抗胰岛素抗体,内源性胰岛素,高,低,负相关,兔和人血中的胰岛素量,诺贝尔 生物医学奖,Berson,Yalou,一、放射免疫分析原理,放射性核素标记的抗原 限量的抗体 被测抗原（或其标准品）
2、放射性复合物的放射性 逆相关 被测抗原的含量,1竞争结合的反应机制,Ag,Ab,+,Ag - Ab,非标记复合物,+,*Ag,一定量,不定量,限量,*Ag-Ab,标记复合物,4,8,4,0,0,8,2,2,24,1,3,B,?,2*Ag一Ab的放射性 与Ag间的逆相关有数学基础,Po： 标记物加待测物的初始浓度 Qo： 特异性结合试剂的初始浓度 B： 标记复合物占总放射性的百分数 F： 游离标记物占总放射性的百分数 R = B/F B + F = 1 Ag-Ab = PQ, Ag = P,B + F = 1,B B 1-F PQ R = = = = F 1-B F P R 1 B = , F
3、= 1+R 1+R PoR PQ = PoB = = Po (1-F) 1+R,PQ = R(Po-PQ) = RPo - RPQ,PQ + RPQ = RPo,PQ(1+R) = RPo,PoR PQ = - = PoB 1+R,B Ag-Ab Ag-Ab PQ R = = = = F Ag Po-Ag-Ab Po-PQ,P + Q PQ PQ PQ K = = (4-1) P Q P(Qo - PQ), B与Po的函数关系, F与Po的函数关系, R与Po的函数关系,Bx,?,800,750,25.4,46.7,3剂量反应曲线(dose response curve) 是定量依据,二、剂量
4、反应曲线,1. 标准曲线斜率对定量测定的影响,甲,乙,2. 影响剂量反应曲线斜率的常见因素,(1) 反应试剂,1)抗体的亲和力,2) 抗原的用量,P + Q PQ,109L/mol,PQ K = - P Q,3) 标准抗原的免疫活性,) 标记抗原的放射性比活度与放射化学纯度,3.7GBq/mg(0.1Ci/mg) 370GBq/mmol(10Ci/mmol),95%,NSB,5) 抗体的用量,5) 抗体的用量,B=33%50%,P非标记趋于零,Po 约等于P标记,P标记4/K,P 标记趋于零,B = 0.33(33%),P标记 = 4/K,B=0.5(50%),(2) 反应方式 (3) 反应条
5、件,放射免疫分析的特点,1. 灵敏度高 检出极限为10-910-12 g / ml, 甚至可达10-15 /ml 2. 特异性强 能识别立体异构体（T3,T4,反T3） 3. 应用范围广：国外（300）,国内（100） 4. 操作简便: 试剂盒，样品不需纯化,放射免疫分析的缺点,1. 易引起误差：生物试剂 2. 时间长：温育 3. 难于超过10-15g / ml：TSH 4. 与生物活性不一定相关：免疫反应,放射免疫分析的基本流程 加样 温育 分离 测B或/和F的放射性计数 绘制剂量反应曲线 求待测抗原的含量(浓度) 签发检测报告,三 放 射 免 疫 分 析 方 法 学,RIA的方法必需具有的
6、条件, 符合一定质量要求的标记抗原 高质量的抗体 高纯度的标准抗原 合适的游离抗原和抗原抗体复 合物的分离方法,. 基 本 的 反 应 试 剂,（ ） 标 准 抗 原,标 准 抗 原 指 具 有 已 知 真 实 含 量 ， 且 不 含 对 免 疫反 应 产生 干 扰 杂 质 的 抗 原。, ） 标 准 抗 原 在 中 的 用 途, 制 备 抗 体 制 备 标 记 的 抗 原 绘 制 剂 量 反 应 曲 线,2 ） 对 标 准 抗 原 的 基 本 要 求, 标准抗原与待测抗原免疫性必须一致 标准抗原必须高纯度 结构纯、化学纯 标准抗原的量必须准确 称 量 、 溶 解 、 稀 释 、 取 样 标准
7、抗原应有很好的稳定性 避免反复冻融、小量分装保存、平行实验,1,2,3,4,5,倍 比 稀 释 法,1,2,3,4,5,倍 比 稀 释 法,1,2,3,4,5,倍 比 稀 释 法,1,2,3,4,5,倍 比 稀 释 法,100g/ml,（） 抗 血 清(antiserum),PQ PQ K =- = - (4-1) P Q P(Qo - PQ) B/F = KQo - K PQ (Scatchard方程) 斜率b = -K, PQ = Ag-Ab + *Ag-Ab PQ = B% Po,）亲和常数,示例：求抗胰岛素血清的值,经稀释的抗胰岛素血清每管加入.1ml ，标记胰岛素的比放射性为7.4u
8、g，每管加入 .1（. g），标准胰岛素的各管浓度见表-1，每管.1ml。总反应体积为0.3ml。,(B%)i = B/T100% , (B/F)i = B/T-B, PQi = (B%)i Poi, 直线延长法 b = Y/X=K = 1.105/2.6610-11 = 4.151010L/mol,1.105,2.6610-11, 直线回归法 y = 1.1175 - 0.42611011 x,y=a+bx B/F=KQo+KPQ,K=1091012L/mol B/F K=Y/X=- PQ (mol/L),） 交 叉 反 应 率 (cross reaction rate),Y 50pg 交叉
9、反应率 = - = - 100% = 0.5% X 10000pg,3) 抗 血 清 的 滴 度 指在无标准抗原 存在时，结合50%标 记抗原时抗血清的稀 释度。,滴度增加 灵敏度提高， 可测范围缩小 滴度减少 灵敏度下降， 可测范围扩大,（） 标 记 抗 原,基本概念： 在抗原的分子中，有一个或两个原子被放射性核素所取代的抗原，称为标记抗原。,（） 标 记 抗 原,要 求 标 记 抗 原 的 免 疫 活 性 与 被 测抗 原 （ 及 其 标 准 品 ） 一 致, 要 有 适 当 高 的 放 射 性 比 活 度 和 放 射 化 学 纯 度,3H: 1.08TBq/mmol(29.2Ci/mmo
10、l) 125I:80.7TBq/mmol(2180Ci/mmol),1）对 标 记 抗 原 的 基 本 要 求,） 标 记 抗 原免疫 活 性 检 验, 剂 量 反 应 曲线 比 较 法 抗 血 清 稀 释曲 线 比 较 法 最 大 结 合 百 分 率 测 定 法,复合物的放射性 （Bo%）= - 100% 参与反应的标 记抗原的放射性,2. 分 离 结 合 与 游 离 物 的 常 用 方 法 （1）非 特 异 分 离 方 法,1）吸 附 法,蛋 白 质 葡 聚 糖 右 旋 醣酐,活 性 炭,2. 分 离 结 合 与 游 离 物 的 常 用 方 法 （1）非 特 异 分 离 方 法,2）沉 淀
11、 法, % 饱和浓度的（4 ）2S ,聚 乙 二 醇 （ 简 称 ）,游离物,复合物,2. 分 离 结 合 与 游 离 物 的 常 用 方 法 （1）非 特 异 分 离 方 法 3）抽 滤 法,2. 分 离 结 合 与 游 离 物 的 常 用 方 法 （2） 特 异性 分 离 方 法 1）双 抗 体 法,家 兔 豚 鼠,羊 、 马,2. 分 离 结 合 与 游 离 物 的 常 用 方 法 （2） 特 异性 分 离 方 法 2）固相 抗 体 法,塑 料 纤维素 凝 胶 颗 粒 多 孔 玻 璃 微 球,2. 分 离 结 合 与 游 离 物 的 常 用 方 法 （2） 特 异性 分 离 方 法 ）葡
12、萄球菌蛋白（）沉淀法,金 黄 葡 萄 球 菌,Fc片段,IgG,Ag-Ab1,Ab2,2.分离结合与游离物的常用方法 （1）非特异分离方法 1）吸附法 2）沉淀法 3）抽滤法 （2）特异性分离方法 1）双抗体法 2）固相抗体法 3）葡萄球菌A蛋白(SPA)沉淀法,分离方式 NSB 简便快速 重复性 适用范围 吸附法 F + 小分子 过滤法 B + 沉淀法 B + 双抗法 B - 好 固相法 B + 差 A蛋白法 B + 好,分离B和F的方法比较,3. RIA 的反应方式与加样程序,(1)平衡法 (2)顺序加样法 (3)一天法,Ag,Ab,*Ag,Ag,Ab,*Ag,.放射免疫分析方法设计,RI
13、A的方法设计内容: 标记物 抗体 标准品 缓冲液 保温条件 分离B和F的方法,.放射免疫分析方法设计 (1) 标记抗原与抗体用量选择 ）标记抗原用量选择,统计误差 最低计数率 抗原的用量,放射性测量统计误差 5%,最低记数率500cpm,10%标记Ag,500/10% = 5000 (cpm),.放射免疫分析方法设计 (1) 标记抗原与抗体用量选择 寻找标记抗原的“减弱浓度”法,用不同浓 度的标记抗原 分别与系列稀 释度的抗血清 反应 ，即在同 一坐标系统绘 制多条抗血清 稀释曲线 。,（ ） 曲 线 工 作 范 围 设 计,下限值确定: 标记抗原用量 （化学量）相当 上限值确定： 绘制B/Bo-log D 剂量反应曲线 高浓度段趁于水平 设置个剂量,标记抗原用量 抗血清稀释度,标记抗 原用量 抗血清 稀释度,曲 线 工 作 范 围,样品浓度低,样品浓度高,（） 反 应 介 质,（ ） 反应的容积、温度及时间,PH7.5 , 离 子 强 度:
