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1、广东医学院 硕士学位论文 砒石对哮喘小鼠氧化应激状态的影响 姓名：谢佳星 申请学位级别：硕士 专业：内科学(呼吸) 指导教师：梁标 20040501 第1 部分 砒石对哮喘小鼠氧化应激状态的影响 摘要 【目的】 通过建立小鼠卵蛋白哮喘模型，给予四种剂量砒石、砒石加硒治疗哮喘 探讨砒石对哮喘小鼠氧化应激状态的影响及抗氧化剂硒的作用。 【方法】 选用6 6 只昆明种雄性小鼠，体重( 2 0 士3 ) g ，随机分为正常对照组和哮喘 组，哮喘组再分为：地塞米松组，砒石0 5 7 5m g k g 组；砒石1 1 5m g k g 组；砒 石2 3m g k g 组；砒石4 6m g k g 组；砒石
2、0 5 7 5m g k g + 硒组；砒石I 1 5m g k g + 硒 组，砒石2 31 I l g ，k g + 硒组；砒石4 6m g k g + 硒组；哮喘组建立卵蛋白哮喘模型 检测肺功能、肺泡灌洗液( B A L F ) q 6 白细胞总数、血浆中8 - 表氧一前列腺素F h ( 8 一I s o p r o s t a n e ) 活性。 【结果】 l 小鼠卵蛋白哮喘模型的建立：致敏三周及诱发哮喘后3 天小鼠支气管及 肺血管周围大量炎症细胞浸润，以E o s 和淋巴细胞为主，气道粘膜水肿、粘液 分泌增加、粘液栓形成、上皮细胞脱落，肺间质及肺泡腔也可见炎症细胞：肺 功能测定表现为
3、呼气时间明显延长，呼气峰压明显增大。 2 哮喘组小鼠肺泡灌洗液( B A L F ) 中自细胞总数、血浆8 - I s o p r o s t a n e 较正常 对照组显著增高( 尸 0 0 5 A s 4 6 + S ev sA s 4 6P 0 0 5 A s 4 6 + S e v s DP 0 0 5 A s 4 6 + S ev sA s O 5 7 5 + S eP00 5 A s 4 6 + S e V S A s l 1 5 + S eP 0 0 5 A s 4 6 + S ev sA s 2 3 + S eP 0 0 5 A s 2 3 + S ev sA 9 1 4 5P
4、 0 0 5 A s 2 3 + S eV S DP 0 0 5 A s 2 3 + S ev sA s O 5 7 5 + S eP 0 0 5 A s 2 3 + S eV SA S l 1 5 + S eP 0 0 5 A s l 1 5 + S ev sA8 5 1 6尸 0 0 5 A s l 1 5 + S ev s A s 4 6P 0 0 5 A s l 1 5 + S e v s D 一P 0 0 5 A s l 1 5 + S eV SA s 0 5 7 5 + S e p0 0 5 A s 0 5 7 5 + S ev sA 8 0 9 7P 0 0 5 A s 0 5
5、7 5 + S ev sA s l 1 5P 0 0 5 、 A s O 5 7 5 + S ev sA s 4 6 P 0 0 5 A s 0 5 7 5 + S e v sDP 0 0 5 Dv s A 7 3 1 1 P 0 0 5 Dv s A s 2 3P 0 0 5 Dv s A s l 1 5P 0 0 5 Dv s A 一6 一P0 0 5 A s 4 6v s A 6 3 1 5P 0 0 5 A s 4 6v s A s 2 3一P0 0 5 A s 4 6v s A s l 1 5 一P 0 0 5 A s l 1 5v s A 5 8 4 3 P 0 0 5 A s l
6、 1 5v sA s 2 3P 0 0 5 A s 2 3v s A 5 6 8 6 P 0 0 5 A s 0 5 7 5v s A 3 9 3 P 0 0 5 ； P 0 0 5 ；q = 5 9 6 0 ，P 0 0 0 1 ；q = 5 7 0 3 ，P 0 O l ； 砒石+ 绿豆粉+ 黄芪给药组心脏脏器系数经方差分析差异无显著性：肝脏脏器 系数经方差分析差异有显著性，各剂量组与对照组比较，P O 0 1 P O 0 0 1 ：肾 脏脏器系数经方差分析差异有显著性，2 0 7 8 m g k g 组与对照组比较，P 0 0 0 1 ， 3 2m g k g 组与对照组比较，P 0 0
7、 1 。 ( 3 ) 病理组织学检查结果 称量脏器后，制作病理切片，步骤：固定一修块脱水。包埋切片H E 染色一封 片。心脏、肝脏、肾脏均出现病理变化，表现为：肝细胞体积增大，胞浆疏松、 透亮；肾小球毛细血管和间质小静脉扩张充血，肾小管上皮细胞肿胀；心肌细胞 多数正常，部分小鼠心肌间质疏松变宽、心肌细胞肿胀。其中，水肿、瘀血、炎 症是心脏、肝脏、肾脏三脏器中共同的病理变化。 其病变程度分为四个等级，判断依据如下：正常：未见明显的病变；轻度： 组织轻度瘀血、水肿，偶见炎症细胞浸润：中度：组织瘀血、水肿、浸润明显， 炎症细胞散在分布，无炎症细胞聚集或灶性坏死区；重度：组织瘀血、水肿明显， 炎症细胞
8、聚集或出现灶性坏死区。 依据小鼠病理组织学改变严重程度分级分别对各脏器在各给药组间进行比较， 采用S P S S l l 0 进行秩和检验，见表2 7 ，表2 8 ，表2 9 。 注：H c = 4 4 1 9 8P = O 1 0 9 7 肝脏病理组织学比较显示差异无显著性。 表2 8 小鼠心脏病理组织学改变严重程度分级比较 注：H c = O 8 2 7 4P - - O 6 6 1 2 心脏病理组织学比较显示差异无显著性。 表2 9 小鼠肾脏病理组织学改变严重程度分级比较 注：H c = O 8 0 13P = O 6 6 9 9 肾脏病理组织学比较显示差异无显著性。 各组病理学改变情况
9、： 砒石给药组 肝脏：肝细胞结构比较完整，但大部分出现肝细胞体积增大，胞浆疏松、透亮： 肝细胞浆内可见红染的颗粒，肝窦变窄；中央静脉扩张充血。 肾脏：肾小球毛细血管和间质小静脉扩张充血，肾小管上皮细胞肿胀：胞浆可见 红染细颗粒，1 8 m g k g 剂量组见肾小管上皮细胞坏死、脱落。 心脏：心肌细胞多数正常，部分出现心肌问质疏松变宽、心肌细胞肿胀，部分心 肌细胞胞浆内可见红染颗粒。1 8 m g k g 剂量组较明显。 砒石+ 绿豆粉给药组 肝脏：肝细胞结构比较完整，但大部分出现肝细胞体积增大，胞浆疏松、透亮； 肝细胞浆内可见红染的颗粒，肝窦变窄：中央静脉扩张充血。个别肝细胞可见少 量淋巴细
10、胞浸润，以2 0 4 7 m g k g 组和2 7 m g k g 剂量组较明显。 。肾脏：肾小球毛细血管和间质小静脉扩张充血，肾小管上皮细胞肿胀；胞浆可见 红染细颗粒。 心脏：心肌细胞多数正常，部分出现心肌问质疏松变宽、心肌细胞肿胀。2 7 m g k g 组较明显。 砒石+ 绿豆粉磺芪给药组 肝脏：肝细胞结构比较完整，大部分出现肝细胞体积增大，胞浆疏松、透亮；肝 窦变窄：中央静脉扩张充血。 肾脏：肾小球毛细血管和间质小静脉扩张充血，肾小管上皮细胞肿胀；胞浆可见 红染细颗粒，3 2 m g k g 剂量组见肾小管上皮细胞坏死、脱落。 心脏：心肌细胞多数正常，部分出现心肌间质疏松变宽、心肌细
11、胞肿胀。3 2 m g k g 剂量组较明显。 图2 1 砒石1 0 3 9 m g k g 组小鼠肝组织病理切片，H E 染色，X 4 0 0 图2 2 砒石2 0 4 7 m g k g + 绿豆粉组小鼠肝组织病理切片，H E 染色，X 4 0 0 图2 3 砒石1 5 7 9 m g k g + 绿豆粉+ 黄芪组小鼠肝组织病理切片，H E 染色，X 4 0 0 图2 4 砒石1 3 6 7 m g k g 组小鼠肾组织病理切片，H E 染色，X 4 0 0 图2 5 砒石1 5 5 6 m 啦g + 绿豆粉组小鼠肾组织病理切片，H E 染色，X 4 0 0 图2 6 砒石3 2 m g
12、k g + 绿豆粉+ 黄芪组小鼠肾组织病理切片，H E 染色，X 4 0 0 图2 7 砒石1 0 3 9 m g k g 组小鼠心组织病理切片，H E 染色，X 4 0 0 例2 8 砒石2 7 m g k g + 绿豆粉组小鼠心组织病理切片，H E 染色，X 4 0 0 图2 , 9 小鼠砒石3 2 m g 像g + 绿豆粉+ 黄芪组小鼠心组织病理切片，H E 染色，X 4 0 0 2 2 2 急性毒性结果及L D 5 0 计算 各组L D 5 0 计算采用改良寇氏法1 1 0 】 计算公式：L D S 0 = l g X m I ( E P 0 5 ) 】 X m 是最大剂量的对数；P
13、为动物的死亡率；P 为各组死亡率之和；i 为相邻两 组剂量比的对数。结果见袅2 1 0 ，2 1 1 ，2 1 2 。 表2 1 0 砒石急性毒性结果及L D 5 0 计算 表2 11 砒材+ 绿豆粉急性毒性结果及L D 5 0 计算 表2 1 2 砒石+ 绿豆粉+ 黄芪急性毒性结果及L D 5 0 计算 2 2 3L D 5 0 参数的显著性检验 采用s P S S l l 0 对各L D 5 0 经对数转换后行方差分析，两两比较采用S N K ( 盯) 检验。标准误( S E ( 5 0 ) ) 计算公式如下1 1 o 】： ( 5 0 ) = 淼L ”= f L D s 。的9 5 可信
14、限的高限一低限J 2 对砒石、砒石+ 绿豆粉、砒石+ 绿豆粉+ 黄芪的L D 5 0 经对数转换后方差分析， F = 3 0 3 0 ，P 0 0 0 0 1 ，显示总体有差别。采用S N K ( q ) 检验进行两两比较：砒石 与砒石+ 绿豆粉比较；q = 5 8 3 9 ，P 0 0 0 1 ，差异有显著性；砒石与砒石+ 绿豆粉+ 黄 芪比较：g = 11 0 0 ，P O 0 0 1 ，差异有显著性；砒石+ 绿豆粉与砒石+ 绿豆粉+ 黄芪比 较：q = 5 8 3 9 ，P 5 3 ，证明蓄积毒性较低。 本实验中，砒石、砒石+ 绿豆粉、砒石+ 绿豆粉+ 黄芪组均表现出相同的急性 中毒症状
15、，先表现为抽搐、烦躁，随后出现精神萎糜、扎堆、瘫卧、甚至死亡。 各系统急性中毒症状的出现率随给药剂量增高而增高。死亡发生在给药后1 h 内， 砒石的L D s o 为1 0 1 2 m g k g ，砒石+ 绿豆粉的L D s o 为1 5 5 2 m g k g ，砒石+ 绿豆粉+ 黄芪的L D s o 为2 2 6 5 m g k g ，砒石的急性毒性按照世界卫生组织19 7 7 年的化学 物质急性毒性分级标准f j7 】属于剧毒。对给药后迅速死亡的小鼠立即解剖，观察 各内脏器官未见异常，称量心脏、肝脏、肾脏的重量；给药后存活至两周的小鼠 f 立即解剖，观察各内脏器官未见异常，称量心脏、肝脏、肾脏的重量，计算各脏 器系数显示，肝脏、肾脏脏器系数较对照组高，P 0 0 1 - P 0 0 0 1 ，差异有显著性； 心脏脏器系数与对照组比较差异无显著性。病理组织学检查显示肝细胞体积增 大，胞浆疏松、透亮：肾小球毛细血管和间质小静脉扩张充血，肾小管上皮细胞 肿胀；心肌细胞多数正常，部分小鼠心肌间质疏松变宽、心肌细胞肿胀，呈非特 异性改变，与文献报道相似，砒石、砒石+ 绿豆粉、。砒石+ 绿豆粉+ 黄芪组的心、 肝、肾脏器系数比较差异无疑著性。 2 - 3 2 绿豆粉、黄芪降低砒石毒性的探讨 中医认为砒石辛酸，热，有毒。( 1 ) 日华子本草：“暖，有毒。”( 2 )
