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1、华中科技大学 博士学位论文 电压依赖性钙通道在人类弱精子症精子中的改变 姓名：李路 申请学位级别：博士 专业：外科学（泌尿外科） 指导教师：刘继红 20070401 华中科技大学博士学位论文 3 答辩论文答辩论文 电压依赖性钙通道在人类弱精子症精子中的改变电压依赖性钙通道在人类弱精子症精子中的改变 中中 文文 摘摘 要要 目的：目的：探讨电压依赖性钙通道病变导致人类弱精子症的发 生作用及其机制。 方法：方法： 将不同浓度的特异性 L-型钙通道拮抗剂硝苯地平在体外与 生育男性经上游优化处理的精液 分别共同孵育 10、20、30、60 min ， 采用计算机辅助的精子分析系统分别检测精子的运动参数
2、， 包括精子活 率、 精子活力分级、 畸形率、 平均路径速度、 精子侧摆幅度和摆动幅度； 然后应用半定量反转录酶-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术分别检测正 常人类运动精子和弱精子症精子中各类型电压依赖性钙通道的功能性 亚单位1 mRNA 相对表达量的变化；最后应用实时荧光定量逆转录-多 聚酶链反应（real-time qPCR） 、免疫印迹(Western blotting)和荧光 免疫细胞化学技术分别检测 L 型 VDCC 功能性 1C 亚单位在正常人类 运动精子和弱精子症精子中的变化。 结果： 结果： 硝苯地平在体外既对人精子形态有明显性改变，也对精子 活率、精子活力分级（a+b 级百
3、分率）、精子侧摆幅度和摆动幅度等指 标的影响差异有非常显著性（p20的样品进行 下一步实验。 3逆转录（Reverse Transcript，RT）：取 500ng 总 RNA 上样进行 RT，按 华中科技大学博士学位论文 22 逆转录试剂盒（Invitrogen 公司）说明书进行。 PCR：取2ul RT产物，200nmol/L divTP,50PM上、下游引物（表1），1.5nmol/L Mgcl2,2.5U Tag酶（Invirogcn公司），总体50ul进行PCR。反应条件：94变性 1min,55退火30s，72延伸60s，行40个循环后，取10ul产物进行作凝胶电泳分 析。 表1.
4、 PCR引物碱其对序列 Table 1. Primer Sequencs of PCR reaction Subunit Primer Gene Bank assession NO. F CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT GAPDH R AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC BC026907 F TCCTCAAGCATTCGGTGGAC 1A R TGCAGGCCCTCTCATTTTTC M94172 F GGCTGGAACGTCATGGACTT 1B R TGAGTCCAGCCCTCCATGGT M94172 F GCCGCGCCGCAGTCAAGTCTA 1C
5、R GCTCCTCCGGGTCTGCATCTCATC L04568 F CGAACGGAGGCATCACCAACTT 1D R ACGGCGGCCTACATCTTCTG M83566 F GCGGCGCCTACAAGCAGA 1E R AAAGCAAAAGATCCCAATGAAATAAGG L27745 F ATCGGCAACATTGTAGTCATCTG 1G R GATGATGGTGGGGTTGAT NM009783 F GGCGTCGTGGTCGAGAACTT 1H R GATGATGGTGGGGTTGAT AF051946 华中科技大学博士学位论文 23 结 果 结 果 我们采用RT-P
6、CR技术对正常成熟活动精子中 VDCCs 的1 亚单位进行检 测。 结果显示1A 和1D 没有被检测，表现为阴性；而其他1 亚单位则依次 为阳性表达：1H（413 bp） 、1G（305 bp） 、1E（348 bp） 、1B（467 bp） 、 1C（479 bp） 。（见图 17） 讨 论 讨 论 自20世纪50年代早期，Dan 观察海胆（sea urchin）精子穿透卵子时，首先发现 了顶体反应 1，2，并观察到该反应依赖于海水中的Ca2+3。随后，Yanagimachi4报道 豚鼠精子的顶体反应依赖于胞外Ca 2+的存在，从而揭开了Ca2+、Ca2+通道与顶体反应 之间的关系。随后的研
7、究证实胞外游离Ca 2+的存在是顶体反应所必须的，Ca2+通过 VDCCs 快速内流使胞内 Ca 2+ 浓度上升，进而促发一系列后续过程，因此对精子细 胞膜上 VDCCs 的研究倍受关注。 自 Darszon5实验室利用双层脂膜（planar bilayer） ，即人工膜蛋白重组技术在 海胆上研究精子膜离子通道开始，逐渐以哺乳动物为实验材料6 、7，近年有关人精 子膜离子通道8的研究也已有报道。结果证明精子膜上存在对 Nifedipine 敏感的L 型VDCC，与我们前期研究相符9。目前，Gonzalez-Martinez 10等证实 VDCC 参 与孕酮介导的细胞外钙内流、精子获能和顶体反应
8、，但对VDCC类型的确定存在争 论11 、12。 近年来随着膜片钳（patch clamp） 、分子克隆和异种表达（heterologous expression） 等技术的应用， 人们可以更加直接观察到精子膜离子通道的存在。 Son13 等利用RT-PCR和RNA探针证实1H 在小鼠胚胎期和出生后23周中均有表达，并 在小鼠睾丸中亦有表达14，这显示 1H VDCCT 对精子形成和器官形成具有调控 作用。Sakata15 、16等则利用RT-PCR和全细胞膜片钳证实 1E 调控小鼠精子的鞭 毛运动。在Goodwin17等利用RT-PCR证实 1C 在人类成熟精子中有表达之后， 华中科技大学博
9、士学位论文 24 Trevino18等利用RT-PCR和荧光免疫共聚焦显微镜技术证实在人精子细胞中存在三 种 T 型 VDCC 的 1 亚单位，即 1H、1G 1E。而Park 19等利用RT-PCR证 实在人活动精子细胞中，除了存在以上三种 T 型 VDCC 的 1 亚单位表达外，还 存在其他非L型 VDCC 的 1 亚单位表达， 包括1B、 1C 和 1I。 Jagannathan20 等则利用RT-PCR、原位杂交和膜片钳证实 1H 和 1G 在人类男性生殖干细胞 中有表达。 我们采用RT-PCR技术对正常成熟活动精子中 VDCCs 的 1 亚单位进行检 测。 结果显示1A 和1D 的基
10、因没有被表达，说明精子中不存在P/Q型和L型 VDCCs，而其他1亚单位如 1H 和 1G 的基因表达表明精子中存在T 型VDCC， 1E 和 1B的基因表达表明精子中存在非 L 型VDCC，以及1C基因表达表明精 子中存在的 L 型VDCC。结合以上各项研究，我们推测在正常的成熟活动精子中， VDCCs 的类型是以 T 型和非 L 型为主，同时也不排除 L 型 VDCC 的存在，它们 互为同源异构体。当受到各种不同刺激因子作用时，相对应类型的 VDCC 起主导作 用，其他则起到相互协调作用，共同完成对精子的运动、获能和顶体反应等正常生 理活动的调节。 华中科技大学博士学位论文 25 参参 考
11、考 文文 献献 1 Dan JC：Studies on the acrosome. Reaction to egg-water and other stimuli. J Biol Bull 103:54,1952 2 Dan JC : sperm entrance in echinoderms, observed with phase contrast microscope. J Biol Bull 99：3399，1954 3 Dan JC:Studies on the acrosome : Effect of Ca2+ deficiency. J Biol Bull 107:335,195
12、4 4 Yanagimachi R , Usui N: Calcium dependence of the acrosome reaction and activation of guinea pig spermatozoa. J Exp Cell Res 89:161,1974 5 Darszon A, Guerrero A, Lievano A, et al. Ionic channels in sea urchin sperm physiology. J News Physiol Sci, 1988, 3:181185 6 Beltran C, Darszon A, Labarca P,
13、 et al. A high-conductance voltage-dependent multistate Ca2+ channel found in sea urchin and mouse spermatozoa. J FEBS Lett. 1994 Jan 24;338(1):23-26. 7 Chan HC, Zhou TS, Fu WO, et al. Cation and antion channels in rat and human spermatozoa . J Biochim Biophys Acta. 1997 Jan 14; 1323(1):117-29 8 Shi
14、 YL, Ma XH. Ion-channels reconstituted into lipid bilayer from human sperm plasma membrane. J Mol Reprod Dev. 1998 Jul;50(3):354-60 9 Li lu, Liu Jihong. Influence of Calcium Channel Blocker on Human Sperm Motility Parameters in vitro. J Chin Exp Surg. 2004；21（6）:725727 10 Gonzalez-Martinez MT, Bonil
15、la-Hernandez MA, Guzman-Grenfell AM. Stimulation of voltage-dependent calcium channels during capacitation and by progesterone in human sperm. J Arch Biochem Biophys. 2002 Dec 15;408(2):205-210. 11 Bonaccorsi L, Forti G, Baldi E. Low-voltage-activated calcium channels are not involved in capacitatio
16、n and biological response to progesterone in human sperm. J Int J Androl. 2001 Dec;24(6):341-351. 华中科技大学博士学位论文 26 12 Garcia MA, Meizel S. Progesterone-mediated calcium influx and acrosome reaction of human spermatozoa: pharmacological investigation of T-type calcium channels. J Biol Reprod. 1999 Jan;60 (1):102-109. 13 Son WY, Han CT, Lee JH, et al. Developmental expression pat
