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1、华中科技大学 硕士学位论文 溶栓酶产生菌的分离筛选鉴定及发酵、提纯研究 姓名：张旭 申请学位级别：硕士 专业：劳动卫生与环境卫生 指导教师：运珞珈 20090501 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 1 溶栓酶产生菌的分离筛选鉴定及发酵、提纯研究 摘 要 目的：豆豉溶栓酶是由从豆豉中分离出的细菌所分泌的一种胞外酶，和日本的纳 豆激酶具有相似的特性。与临床上常用的纤溶药物相比，具有许多优点：效价高、半 衰期长、无抗原性、安全无毒、成本低廉等，有望开发成新一代溶栓药物，本课题拟 对全国不同地方收集的豆豉样品进行分离筛选，得到可以产生纤溶酶的菌株，并对该 菌株及其产生的酶进行一些基础研
2、究，包括菌种鉴定、液体发酵探讨以及酶的分离纯 化。 方法：1.酪蛋白平板初筛，纤维蛋白平板复筛，得到产溶栓酶的细菌。2.对该菌 株进行生理生化及 16SrRNA鉴定， 确定种属。 3.采用单因素和正交实验相结合的方法， 探讨液体发酵的最佳培养基和发酵条件。4.经过硫酸铵分段盐析，透析脱盐，G- 50 柱 层析，分离得到酶的纯品并冷冻干燥保存。5.纤维蛋白平板法测定酶活，考马斯亮蓝 G- 250 法测定蛋白质含量，计算整个提纯过程中酶活的回收率和比酶活。6.SDS- PAGE 电泳，考马斯亮蓝 R- 250 染色，确定酶的分子量。 结果：1. 筛选到 8 株具有溶栓活性的菌株，以活性最高的一株菌
3、 XY- 1 作为研究 对象。2. 经生理生化和 16S rRNA鉴定后，确定该菌为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） 。3. 培养基的最佳组成为：酵母提取物 1%、乳糖 3%、 K2HPO4 0.1%、KH2PO4 0.6%、MgSO4 0.1%、NaCl 0.05%、pH 9.0。最佳发酵条件为： 温度 35、装液量 50ml/250ml、接种量 500l/50ml、发酵时间 24h。4. 经过整个提纯 周期，豆豉溶栓酶的酶活回收率达到 37%，蛋白质回收率 19.8%，比酶活为 1388.27 U/mg，纯化倍数为 1.87 倍。5. 真
4、空冷冻干燥得到粉末状酶制品，上 SDS- PAGE电泳 显示两条带，分子量约为 12k 和 20k。 结论：我国传统食品豆豉中同样可以分离到产溶栓酶的细菌，经生理生化和 硕士研究生：张 旭 导 师：运珞珈 副教授 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 2 16SrRNA鉴定后确定为解淀粉芽孢杆菌。 采用单因素和正交实验结合的方法优化液体 发酵，效果较好，使产酶量由 235.2U/ml 提高到 2089.3U/ml。经过整个分离提纯过 程，酶活回收率虽较高，但纯化倍数不高，样品中含有两种蛋白质，对分离纯化方法 有待于进一步研究。 关键词：豆豉溶栓酶，解淀粉芽孢杆菌，菌种鉴定，液体发酵优
5、化，分离纯化 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 3 Purification and Characterization Research of a Fibrinolytic Enzyme Produced by Bacteria Screened From Douchi Master Candidate: Xu Zhang Academic Adviser: Vice- Prof Luojia Yun Abstract Objective: Douchi Fibrinolytic Enzyme (DFE) is an exoenzyme which is secreted by
6、bacillus isolated from Douchi. It has similar characteristic with Japanese Nattokinase. Compared with these thrombolytic drugs usually used in clinical treatment, DFE has a lot of advantages, such as high potency, long half- life, none antigenicity, none toxicity and safe, low price, and may be deve
7、loped into the next generation of thrombolytic drugs. We plan to isolate and screen bacterial strains with fibrinolytic activity from Douchi, collecting from different district in China. The study is focused on the DFE and the strains that produce DFE, including: strain identity, optimization of liq
8、uid fermention and purification of DFE. Method: 1.By casein plate prescreening and fibrin plate postscreening, to get bacterial strains with fibrinolytic activity. 2. To identify the bacteria by physiology, biochemistry and 16SrRNA test. 3. Adopt single factor method and Orthogonal experiment method
9、 to discuss the best culture medium and fermentation condition of liquid fermentation. 4. To get the purity powder by ammonium sulfate subsection precipitation, dialyzation to remove the salt, Sephadex G - 50 chromatography and vacuum freezing desiccation. 5. The protein content and fibrinolytic act
10、ivity was determined by coomassie brilliant blue G- 250 dyeing method and fibrin plate method. Calculate the enzyme activity yield and specific activity. 6. SDS- PAGE electrophoresis, coomassie brilliant blue R- 250 dyeing, confirm the molecular weight of the enzyme. Result: 1. Eight bacterial strai
11、ns with fibrinolytic activity were isolated from Douchi. The strongest fibrinolytic activity strain naming XY- 1 was selected as the research object. 2. 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 4 XY- 1 was identified as Bacillus amyloliquefaciens by testing its morphology, physiology, biochemistry and 16S rRNA. 3. T
12、he best composition of culture medium are: yeast extract 1%, lactose 3%, K2HPO4 0.1%, KH2PO4 0.6%, MgSO4 0.1%, NaCl 0.05%, pH 9.0. The best fermentation conditions are: temperature 35 , 250ml flask contains 50ml medium, inoculation quantity 500l/50ml, fermentation time 24h. 4. After all the purifica
13、tion steps, the DFE activity yield was 37%, protein yield was 19.8%, specific activity was 1388.27U/mg, and purification fold was 1.87. 5. We got purity DFE powder after vacuum freezing desiccation. The SDS- PAGE shows two electrophoretic bands, the molecular weight were about 12k and 20k. Conclusio
14、n: We could also isolate bacteria which can produce fibrinolytic enzyme from Chinese traditional food Douchi. After physiology and biochemistry test, we identified sp. XY- 1 as Bacillus amyloliquefaciens. Associate application of single factor method and Orthogonal experiment method have remarkable
15、effect to the optimization of liquid fermentation. The DFE production can reach 2089.3U/ml from 235.2U/ml. Although the enzyme yield was high, the purification fold was low, and two kinds of protein were still contained. The purification method needs to be investigated further. Keywords: Douchi Fibr
16、inolytic Enzyme, Bacillus amyloliquefaciens, Bacteria strain identify, liquid fermentaion optimization, separation and purification 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承 担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和 借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 ，在_年解密后适用本授权书。 不保密。 （请在
