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1、需实验27质粒提取与电泳艘窒tr髓霞髓0nandTQertificatiomofRecombinantPlasmidnRs河ErEz【生物化学与分子生物学系实验目的工学习碱裂解法提取质粒的原理2、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和方法3、掌握质粒提取及鉴定的基本操作实验原理质粒(Plasmid)是细菌染色体外的遗传物质,为环形闭合的双股DNA。质粒具有可自主复制-传给子代、-也可丢失及在细菌之间转移等特性,与细菌的遗传变异有关。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。碱裂解法提取质粒的原理质粒DNA较染色体DNA小,一具有超螺旋共价闭合环状的特点。碱变性条件下.染色体DNA双螺旋解开而变性,而质粒D
2、NA郭分觞开,双链不会完全分离。PH调至中性,变性的质粒DNA恢复到原来的构型,而染色体DNA不能复性,与蛋白质一起沉淀。DNA琼能糖凝胶电泳琼脂糠线性的多联物,在水中一般加热到901C以上溶解,温度下降到35-40C时形成良好的半固体状的凝胶。1-2%琼脂糖凝胶12g琼脂精粉/100ml凝胶缓冲波溴乙锭(CEB)可以慨入DNA堕础碳基之间,与DNA的结合无假基特异性。结合于DNA上的EB在綦外光激发下坂现褐红色荧光。溴乙锭有剧毒,高致癌性,实验时应戴专用手套,避免接触。电荷效应与分子筛效应核酸从负极向正极泳动,小分子泳动速度较快离心机的使用利用离心力,分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中
3、各组分的机械。可调节变量:转速(rpm或g);时间;温度离心机的使用原则:质量配平;位置平衡实验步骤取1.Sml菌液,9000rpm高心30秒,尽可能的倒干上清。用250HlI溶波Pl重悬菌体沉淀,枪头反复抽吸至菌体彻底悬浮。Pl葡萄糊,制造低淆环境,增加细菌细胞膜的通透性;增加溶波的粘稠度,使悬浮后的大肠杆菌不会快途沉底。EDTA:整合核酸酶加250HI溶波P2,温和地上下翻转10次使菌佛充分裂解至清亮。P2:NaORMASDS游湾,是最佳阡滑俞组胞的话剂。NaOH使DNA变性,SDS使蛎白质变性。染色体与蛋白质缠络加350HI溶液P3,立即温和地上下翻转10次,放置Smin。P3:,醋酸商
4、戛钾溶波,使溶波pH值恢复接近中性。此时质粒DNA复性,而染色体DNA难以复性。SDS逼到K:变成十二烷基硫酸钾,不溶于水,连同结合的蛎白质和缠绕其上的染色体DNA共同沉淀。13000rpm离心10min,小心取上清。将上清波加入吸附柱中,13000rpm离心Imin,弃滤波。加500u去蛋白液PB,13000rpm离心Imin,弃滤波。加500UI漂洗波WB,13000rpm高心Imin,弈滤液。(重复一遍)空柱,13000rpm高心2minl,除去成留乙醇,取出服附柱,放入干浑离心管中,在货附膜中间部位加40UI洗脱缓沥液EBB,放置2min。13000rpm高心Imin洗脱DNA,-20C保存。琼脂糖凝胶电泳配胶:琼脂糖濮胶粉,溶于TBE缓冲液中,配成18%1.2%的琼脂糖凝胶样品;10ul质粒样品+2ul上样缓冲液,混匀上样:,将样品用微量移液器加入凝胶孔中电泳:90120mA,电泳2040min实验结果迈chutou.co
