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1、陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,电子显微镜技术,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,第一章 绪论 A1 电子显微镜技术发展历史 B1 电子显微镜的诞生 电子显微镜是在 1931年，由德国科学家Enest Ruska和 Max Knoll首先发明的。虽然他们的第一台用电子束和电磁透镜组成的显微镜只将铜网放大了12倍，但是却揭开了用电子显微镜探索微观世界的新篇章。1986年，世界上第一台透射电镜的发明者ERuska与发明扫描隧道显微镜的科学家GBinnng和HRohrer一起荣获诺贝尔物理奖。 B2 光学显微镜和电子显微镜的差别,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,A2 电子显微镜技术现
2、状 B1 仪器性能的进步和完善： 分辨力的提高 放大倍数的增大 功能的多样化,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,B2 样品制备技术的协同发展： 表现样品的二维超微结构、应用广泛的超薄切片术； 显示表面超微结构、立体感较强的扫描电镜样品制备技术； 呈现生物膜的断裂面超微结构的冷冻蚀刻技术； 用于细胞内化学成分的定性和定位研究的电镜细胞化学技术； 进行细胞内抗原（抗体）的定性和定位研究的免疫电镜技术； 探测细胞内大分子合成、运输动态过程的电镜放射自显影技术； 研究病毒和生物大分子等悬浮材料的负染术.,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,A2 电子显微镜技术的应用与未来 B1 电镜技术的应用：
3、 C1 生命科学方面： Dl 细胞生物学： 用电镜技术发现并揭示了细胞内各种细胞器的超微结构，特别是细胞骨架系统和生物膜的超微结构；促进了对细胞的结构及其功能的研究，如：细胞生理和生化、细胞通讯与运输、细胞分裂与分化、细胞增殖与调控等。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,D2 分子生物学： 用电镜技术揭示了核酸和蛋白质大分子的超微结构，并对其进行了亚显微测量；还研究了染色体的超微结构，拍摄了DNA转录mRNA的过程，观察到了灯刷染色体、巨大多线染色体和在染色质纤维上间隔排列的球形核小体，并研究了核小体的化学组成和分子结构。另外，还进行了核酸分子杂交和编接基因缺失的观察与研究，以及核糖体和蛋
4、白质合成机制的研究等。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,D3 动物学和植物学: 用电镜技术进行了广泛的细胞超微结构的研究，特别对动植物的分类学研究作出了贡献。 D4 微生物学： 用电镜技术揭示了病毒、细菌和支原体等的超微结构，促进了微生物发育史的研究，并发现了新的细菌、病毒和类病毒等。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,C2 医学科学方面： Dl 基础医学： 电镜技术为超微病理学的研究提供了先进的手段，如：对病变细胞超微结构的研究，有助于探索病因和治疗的机理。特别是高分辨力的电镜更促进了分子病理学的产生与发展；在中医基础理论的研究方面也获得了广泛的应用，如：针刺机理和中草药药理的研究
5、等。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,D2 临床医学： 免疫电镜技术为研究疑难病症的诊断与治疗开辟了道路，如：对天花等病症，用免疫电镜技术可以在数分钟内作出明确的诊断；另外对病毒性肝炎、肾病、血液病和肿瘤的分类和诊断也显示出了优势。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,C3 农林科学： 电镜技术在植物保护、良种繁育、土壤改良、成分分析、品种的分类与鉴定和动植物各种疾病的病因、诊断与防治方面的研究都获得了快速进展。 C4 材料科学： 可用电镜对各种非金属和金属材料的超微结构进行鉴定和检测，以及进行新型材料的研制等。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,B2 电镜技术的未来： C1 多技
6、术、方法的相互协作： C2 仪器装置的不断完善 C3 计算机技术的不断渗入 C4 电镜样品制备技术的不断创新,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,第二章 电子显微镜的基本知识 电子显微镜（以下简称电镜， Electron Microscope， EM）是揭示生物样品超微结构的有力工具。为便于初步了解常用电镜的名称及其基本构造、成像原理和应用范围，以及在操作时需注意的问题等，本章将对透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）、扫描透射电镜（STEM）和超高压电镜（UHVEM）等分别作介绍。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,A1 透射式电子显微镜 B1 透射电镜的基本构造 透射电镜（Trans
7、mission Electron Microscope，TEM）属于大型精密仪器，主要由电子光学系统、真空系统和供电系统三大部分组成。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,C1 电子光学系统 电子光学系统又分为电子枪、磁电子透镜、样品室和观察记录装置等几个部分。 D1 电子枪： 电子枪是电子光源的发射装置，由阴极、栅极和阳极组成。一般阴极是钨丝制成的极细小的 V型灯丝，当通电加热到2 227以上时，其尖端即发射电子。栅极位于阴极和阳极之间，用来控制电子发射的强度，并将阴极发射的电子挤压成直径小于100m的束流，这个极微小电子束的集合点（又称交叉点）就是电镜的光源。而阳极与阴极之间有极大的电位
8、差，可对电子束产生巨大的加速作用。另外阳极还有调节电子波长的作用，阳极的电压越高，电子波长越短，电镜的分辨力就越高。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,D2 磁电子透镜系列： 磁电子透镜包括聚光镜、物镜、中间镜和投影镜。聚光镜的作用是汇聚电子束，控制照明束斑和孔径角的大小，以减少能量的损失，使更多的电子束投射到样品上，并成像放大。 物镜是短焦距强磁透镜，它把样品的精细结构作第一次约60倍的放大，称初级放大像。物镜的精确度和清洁度非常重要，它的质量优劣与电镜的分辨力有直接关系，物镜的质量越好，电镜的分辨力越高。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,中间镜和投影镜的作用是把初级放大像进一步放
9、大成最终像，呈现在荧光屏上以供观察。中间镜又叫衍射透镜，是长焦距弱透镜，其倍数可变，用来控制总的放大倍数。此外，中间镜内装有可活动的限场光阑和半固定的反差光阑，用以提高成像的质量。投影镜位于中间镜的下方，是短焦距强透镜，它把中间镜形成的放大像再次放大，使电镜的最高放大倍率可达100万左右。由此看来，真正能起图像放大作用的是投影镜。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,D3 样品室： 样品室位于聚光镜和物镜之间，作用是稳定地承载样品和水平移动样品。有两种类型的样品室：顶落式和侧插入式。为了在换样品时不至破坏整个镜筒的真空，样品室单设有气锁装置，使电镜观察时换样品简便易行。有时同一台电镜设计两种
10、样品室，需要高分辨力时用顶落式，不需要高分辨力时用侧插式。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,D4 观察和记录装置： 观察装置位于镜筒的下方，包括荧光屏、观察窗和立体光学显微镜。荧光屏上涂有黄绿色的荧光粉，是由硫化锌镉类制成的，并加入微量的Ag、Cu等激活剂，它的作用是将电子束所带的样品信息转换成光讯号，呈现清晰的图像。一台电镜一般有左中右三个观察窗，能几个人同时观察。另外窗玻璃中含有铅，用以防护X-射线的追出。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,记录装置包括照相室、曝光操纵杆和自动曝光计时装置等。照相室位于荧光屏的下方，内装有上下两个暗盒，分别用于存放未曝光的和已曝光的底片。曝光操纵
11、杆一般位于操作者的右手方向，当拉起操纵杆时，荧光屏随之抬起，带有样品信息的电子束就射在胶片上。由于电镜的景深较长，所以在荧光屏上聚好焦以后，位于其下方的胶片上亦会得到清晰的图像。用自动曝光计可以事先设定曝光时间，一般在l4秒之间选择。目前多数电镜可在底片上打印出多种参数，如：加速电压值、放大倍率、底片编号、放大标尺、操作者代号和拍照时间等。有的新型电镜还装有电视图像系统和真空外照像系统，可以更多地记录观察信息，更方便地分析比较图像。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,C2 真空系统 电镜的真空系统主要包括真空泵，一般分机械泵和扩散泵两级。此外还有分子涡轮泵和离子泵等其它种类，适宜高分辨力的
12、场发射电镜使用，真空可达10-91010乇（Torr）。另外，真空系统还包括阀门、真空管道和检测装置等。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,C3 电源系统 主要包括小电流高压电源和大电流低压电源两部分。用前者加速电子和加热灯丝；后者供磁电子透镜聚焦和成像。两种电源必须非常稳定。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,B2 透射电镜的成像原理 C1 电子束与样品的相互作用 D1 电子束与样品的相互作用后产生的信息: 入射电子束与样品相互作用之后，产生多种信息。如：直接透射电子、俄歇电子、二次电子、背散射电子、X-射线、小角度弹性散射电子、大角度弹性散射电子、非弹性散射电子和阴极发光现象等。,
13、陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,D2 与透射电镜成像有关的信息： （1）透射电子：因为透射电镜的样品是超薄切片，薄到足以使一部分入射电子不受到阻碍而直接穿透，这类电子被称为“透射电子”。加速电压越高，这种透射电子的能量越大。所以观察较厚的切片或活细胞要选用高压电镜或超高压电镜，其加速电压达500kV以上，甚至几千kV，而一般透射电镜的加速电压为25100kV。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,（2）非弹性散射电子：当入射电子与样品的原子核周围的电子云相互作用时，因为入射电子的速度比绕原子核运动的电子的速度快得多，而二者的质量却相同，所以互相碰撞时会重新分配其总能量，使高速运动的入射
14、电子的方向和速度发生变化，即通常所说“带有了样品的信息”。我们把这种入射电子束与样品的相互作用称为“非弹性散射”，而把作用后带有样品信息的入射电子称为“非弹性散射电子”。因为样品中电子的数目很多，从而产生的非弹性散射电子的数目也很多，所以非弹性散射电子在成像过程中起重要的作用。一方面改变了入射电子的方向，另一方面由于损失了一部分能量，致使图像模糊，形成像差。使样品尽量薄和尽量加大入射电子的能量可以降低非弹性散射引起的像差。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,（3）小角度弹性散射电子：入射电子与样品中的原子核相碰撞时，由于原子核的质量比电子的质量大得多，会使快速运动的入射电子偏斜，我们把这种
15、现象叫“弹性散射”，而作用后带有样品信息的入射电子被称为“弹性散射电子”，但其能量的损失可忽略不计。由于物镜光阑的直径只有2070m，所以偏斜角度大于物镜接受角的弹性散射电子被挡住，而只有偏斜角度小的弹性散射电子可通过物镜光阑，并参与电子显微镜的成像过程。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,C2 样品的成像反差 D1 成像反差的形成 电镜样品成像的质量与样品成像的反差有关。通常样品成像的反差指的是肉眼能辨别出来的光强度的变化，又称振幅反差。它表现为在电镜下样品成的像与它的背景有亮度的差异。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,当电子束通过超薄样品时，由于构成样品的原子间的距离有01nm以
16、上，而原子核与电子的大小只有10-610-7nm。这种巨大的差异使入射电子中只有极少部分会与原子核或轨道电子碰撞，并形成不同角度的弹性散射电子或非弹性散射电子。而绝大部分入射电子能直接透过样品并构成图像背景的主体，在荧光屏上形成亮区。位于样品室下方的物镜光阑进一步限定了物镜的接收角，只让弹性散射或非弹性散射角小的电子通过，在荧光屏上形成相应的暗区。由于样品的厚度和质量的不均一，可通过光阑的小角度的弹性散射电子和非弹性散射电子也疏密不一，在荧光屏上形成的暗区就深浅不一了，这使电子成像有了不同的明暗层次。,陕西师范大学生命科学学院细胞学教研室,D2 欠焦与 “费涅尔条纹” 在入射电子穿透样品时，样品中的质量和厚度有差异的区域会出现一种“费涅尔条纹”，其在欠焦时以亮线勾画这些区域的边缘；在过焦时以黑线勾画这些区域的边缘，犹如给美术字描细边，都有突出结构边缘使图像更清晰的作用。而在正焦时，这种“费涅尔条纹”却完全消失，倒显得图像的反差最小。所以在稍欠焦或稍过焦时拍照，既不影响图像的聚焦质量，又能加强图像的反差。基于这种现象，电镜工作者往往利用稍稍高焦
