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1、汕头大学 硕士学位论文 汕头地区急性呼吸道感染患儿中HCoV-NL63的检测及分析 姓名：胡叶养 申请学位级别：硕士 专业：儿科学 指导教师：林广裕 20090501 汕头大学医学院硕士学位论文 摘 要 目的 了解汕头地区急性呼吸道感染患儿的感染病原体中是否存在人冠状病毒 NL63 （HCoV-NL63） ，分析其 1a 基因的部分核苷酸序列，并探讨其流行规律及所致疾病的临床 特征。 材料和方法 选择 2007 年 5 月至 2008 年 10 月收集的急性呼吸道感染患儿鼻咽拭子标本 690 份， 及健康对照组儿童呼吸道标本 83 份，并记录其性别、年龄、诊断、主要症状等以供分析 研究。应用针
2、对 HCoV-NL63 的 1a 或 1b 基因的 RT-PCR 引物进行 HCoV-NL63 基因片段检 测，对所有阳性产物进行核苷酸序列测定，将其中 1a 基因阳性产物的核苷酸序列与 GeneBank 中所公布的相关序列进行比较分析， 并对阳性标本进行其它 9 种呼吸道病毒的检 测。同时，对 HCoV-NL63 阳性病例的临床资料进行分析。 结果 690 份标本中，共检出 7 份 HCoV-NL63 阳性标本，阳性率为 1.0%（7/690） ，且均为 单一病毒感染，83 份健康对照组标本中均未检出该病毒。7 份 HCoV-NL63 阳性标本中，3 份为 1a 基因阳性，核苷酸序列同源性比
3、较结果显示三者的同源性为 86.0%97.4%，与 GeneBank 中公布的国外及国内多株 HCoV-NL63 1a 基因同源性比较结果为 79.2%99.5%， 基因进化树分析显示存在 2 种不同的基因型。7 名阳性病例中女性 6 名，男性 1 名，年龄 在 4 月4 岁之间，2 岁的患儿占阳性病例的 71.4（5/7） 。临床诊断分别为上呼吸道感 染（2 例） ，上呼吸道感染并高热惊厥（1 例） ，喘息型肺炎（3 例） ，毛细支气管炎（1 例） 。 7 例阳性标本的采集时间为 8 月10 月，其中 10 月份阳性率最高，为 3.8%（3/79） 。 结论 汕头地区急性呼吸道感染患儿的感染
4、病原体中存在 HCoV-NL63，感染者以婴幼儿为 主，可表现为上呼吸道或下呼吸道感染症状，其中下呼吸道感染者伴有喘息症状，感染高 峰在夏秋季节。 关键词：人冠状病毒；人冠状病毒 NL63；急性呼吸道感染；基因测序 I 汕头大学医学院硕士学位论文 Abstract Objective To investigate the possible existence of human coronavirus NL63 (HCoV-NL63) among the children with acute respiratory infection in Shantou, analyze partial n
5、ucleotide sequences from its 1a gene, and explore its epidemiology and clinical features. Materials and methods From May 2007 to October 2008, 690 specimens of nasopharyngeal swab were collected among the children with acute respiratory infection, and 83 specimens were collected among the healthy ch
6、ildren. Sex, age, diagnosis, and the main symptom of each child were recorded. RT-PCR was performed to detect HCoV-NL63 from these specimens, using primers designed for the 1a/1b gene from this virus. All of the positive RT-PCR products were selected for gene sequencing, and sequences of the 1a gene
7、 positive products were compared with the published sequences in the GeneBank. Detection of other common respiratory viruses was then preceded in all of the HCoV-NL63 positive specimens. Furthermore, clinical materials of the HCoV-NL63 positive cases were analyzed. Results Seven specimens were HCoV-
8、NL63 positive from the 690 specimens (1.0%), compared with none from the control group. And all of these seven specimens were single virus infected. Three were 1a gene positive from the seven HCoV-NL63 positive specimens. Sequence distances of these three 1a genes varied from 86.0% to 97.4%. Compare
9、d with HCoV-NL63 1a gene published in the GeneBank, sequence distances varied from 79.2% to 99.5%. Phylogenetic tree analysis revealed two different genotypes. Among the seven HCoV-NL63 positive patients, six of them were female, and only one case was male. Age distribution of them varied from 4 mon
10、ths to 4 years, and mainly within 2 years (71.4%). Clinical diagnoses of these patients were upper respiratory infection (2), upper respiratory infection accompanied with febrile seizures (1), asthmatic pneumonia (3), bronchiolitis (1). Those HCoV-NL63 positive specimens were collected from August t
11、o October, and infection of this virus most occurred in October (3.8%). II 汕头大学医学院硕士学位论文 Conclusion HCoV-NL63 was one of the viral pathogens among children with acute respiratory infection in Shantou. The infection mainly occurred in early life. HCoV-NL63 caused both upper and lower respiratory trac
12、t infections, and those lower respiratory tract infected patients suffered from wheezing. HCoV-NL63 was significantly more prevalent in late summer and autumn. Key words: human coronaviruses, HCoV-NL63, acute respiratory infection, gene sequencing III 汕头大学医学院硕士学位论文 英文缩写表 英文缩写 英文全名 中文译名 HCoV-NL63 hum
13、an coronavirus NL63 人冠状病毒 NL63 HMPV human metapneumovirus 人偏肺病毒 HBOV human bocavirus 人博卡病毒 RSV respiratory syncytial virus 呼吸道合胞病毒 IVA influenza virus A 流感病毒 A 型 IVB influenza virus B 流感病毒 B 型 PIV1 parainfluenza 1 副流感病毒 1 型 PIV3 parainfluenza 3 副流感病毒 3 型 ADV adenovirus 腺病毒 RHV rhinovirus 鼻病毒 NPS nas
14、opharyngeal swab 鼻咽拭子 ARI acute respiratory infection 急性呼吸道感染 IV 汕头大学医学院硕士学位论文 学位论文原创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文 中除特别加以标注和致谢的地方外，不包括其他人或其它机构已经发表或撰 写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明 确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 作者签名：_ 日期：_年_月_日 学位论文使用授权声明 本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅 和借阅；学校可将本学位论文的全部或部分内容编入
15、有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其它复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关 部门或机构送交论文并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部 分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序处理。 本论文属于：保密（ ） ，在 年解密后适用本授权声明。 不保密（ ） 。 （请在以上括号内打“” ） 作者签名：_ 导师签名：_ 日期：_年_月_日 日期：_年_月_日 汕头大学医学院硕士学位论文 第 1 章 前 言 急性呼吸道感染（ARI）是人类最为常见的感染性疾病之一，其发病率高、传播快， 对人健康危害极大，是导致 5 岁以下儿童死亡的主要原因。在儿童呼吸道感染疾病中，病 毒病原
16、占据着重要地位，高于 90%的急性呼吸道感染由病毒引起。目前已确定的常见呼吸 道病毒包括鼻病毒（RHV） 、呼吸道合胞病毒（RSV） 、流感病毒（IV） 、副流感病毒（PIV） 、 腺病毒（ADV）等。而近年相继发现的人博卡病毒（HBOV） 、人偏肺病毒（HMPV）及新 型人冠状病毒（HCOV）等新生病毒，则是现阶段儿科领域病原学的研究热点。 20 世纪 60 年代，两种人冠状病毒 HCoV-229E 和 HCoV-OC43 先后被发现，通过感染 健康的志愿者，发现这两种病毒可导致普通感冒，自此，人冠状病毒被认为是相对无害的 呼吸道病原体。然而，随着 20022003 年 SARS 冠状病毒（SARS-CoV）的流行，这种观 念被彻底打破。SARS 的暴发，使人们加深了对人冠状病毒的认识。随着细胞培养和分子 生物学技术的发展， 两种新型人冠状病毒 HCoV-NL63、 HCoV-HKU1 分别于 2004 年及 2
