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1、高精度PCR技术 在肝病诊疗中的价值,病毒性肝炎感染,世界性流行，是一个严重的公共卫生问题。 据世界卫生组织报道，全球60亿人口中，约20亿人曾感染过或正感染HBV，其中3.5亿人为慢性感染者，每年约有60万人死于与HBV感染相关的肝病。 近年来，我国在慢性乙型肝炎（乙肝）防治领域取得了重要进展。,“十一五”重大传染病专项计划病毒性肝炎重大研究专项启动,2009年，我国病毒性肝炎领域最重要的进展是国家“十一五”重大传染病专项计划:“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项启动（见表1）。 这是“十一五”期间与“载人航天与探月工程、大型飞机”等相平行的16个重大专项计划之一。,表1 国家
2、中长期科技发展规划纲要 （20062020年）确定的重大科技专项,主要内容,临床对高灵敏度乙肝病毒核酸定量的需求 我国乙肝病毒核酸定量PCR检测技术现状 艾迪康提供两种高灵敏度病毒核酸检测,血清HBV DNA水平是临床上评价HBV复制情况的“金标准”,Lok AS, et al. Hepatology. 2009;50:661-662 Liaw YF, Liver International, 2009,29(s1):100-1-7,2012： HBV DNA detection and HBV DNA level measurement are essential for the diagn
3、osis, decision to treat and subsequent monitoring of patients (A1). Follow-up using realtime PCR quantification assays is strongly recommended because of their sensitivity, specificity, accuracy and broad dynamic range 3841 (A1).,2009： Recently, HBV DNA assays that utilize real-time PCR technology w
4、ith improved sensitivity(5-10 IU/mL) and wider dynamic range (up to 8-9 log10 IU/mL) have become available,乙肝治疗指南：美国和欧洲,Hepatology, 2009 J Hepatol, 2012,Hepatol Int，2012,乙肝治疗共识：2012亚太(1),Hepatol Int，2012,乙肝治疗共识：2012亚太(2),Hepatol Int，2012,乙肝治疗共识：2012亚太(3),HBV DNA载量PCR检测的国际指南,谁需要检测： HBsAg阳性患者和HBsAg阴性的
5、高危人群 携带者、慢乙肝患者、肝硬化和肝癌患者 什么时候检测： 未治疗患者、治疗前、治疗中、结束治疗后均需检测,HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用,HBV DNA载量检测在治疗优化路线图中的作用,抗病毒治疗前病毒基线的准确测定： 适宜抗病毒治疗患者选择、抗病毒治疗方案的确定、抗病毒疗效的预测与后续疗效比对 抗病毒治疗过程中疗效的评估和方案优化、耐药突变检测和治疗终点的确认 抗病毒优化治疗停药后随访及复发再治的判断 隐匿性病毒性肝炎的诊断,高灵敏度核酸定量检测的临床意义,HBV 核酸定量PCR检测的国际指南要求,超敏感性（Hypersensitivity） HBV最低检测限10-15
6、 IU/ml 宽线性范围（ wider dynamic range ） 涵盖101109 IU/ml 高特异性（ High specificity） 可重复性好（ Repeatability）,主要内容,临床对高灵敏度乙肝病毒核酸定量的需求 我国乙肝病毒核酸定量PCR检测技术现状 艾迪康提供两种高灵敏度病毒核酸检测,HBV DNA 检测临床应用,血清HBV DNA定量,目前多以荧光实时PCR技术作为检测手段； HBV DNA定量的表达多以拷贝/毫升（copies/ml）或国际单位/毫升（IU/ml）表达，二者之间粗略的换算方法为1 IU/ml = 5 copies/ml。 血清HBV DNA定
7、量检测的发展方向为更高敏感性（sensitivity）和更宽的动态范围（dynamic range）。,HBV DNA定量使用低灵敏度试剂的后果,临床实践中影响临床疗效的准确评估，从而使病人疗效出现偏差 临床研究中弱化抗病毒疗效,国产HBV DNA PCR试剂性能现状,中华检验医学杂志，2012,现有的国产试剂在检测灵敏度、线性范围、可重复性等方面无法满足临床上日益增加的对HBV DNA定量准确性和灵敏度的要求 部分试剂缺乏内参，影响定量准确性,主要内容,临床对高灵敏度乙肝病毒核酸定量的需求 我国乙肝病毒核酸定量PCR检测技术现状 艾迪康提供两种高灵敏度病毒核酸检测,高灵敏度HBV DNA较普
8、通检测 符合国际乙肝治疗指南和标准,*建议100IU/ml以下患者选用cobas高灵敏,20例患者组成特点 -9例服用ETV、11例服用ADV（48周） -10例大三阳、8例小三阳患者、 2例小二阳患者,*包括1例服用ETV患者,高灵敏度 HBV DNA检测 及时判断病毒突破、及时调整治疗决策,高灵敏核酸检测与普通核酸检测比较,数据来源：北京大学人民医院,普通PCR法 “假阴性”率高达45% (9/20),以核苷类药物为基础的治疗 ： 用药 24周时（拉米夫定/替比夫定）或48周时（阿德福韦）出现病毒学应答（HBV DNA检测不到），则可预测耐药的发生率低，亦即持续病毒学应答的机会得到提高，并
9、且HBeAg阳性患者抗HBe血清学转换的机会更高。,乙肝治疗期应答的预测因素：HBV DNA,高灵敏度检测方法在治疗中的应用,以IFN/PEG-IFN为基础的治疗 HBeAg阳性患者 ： 1.在治疗的第6/12月与治疗后的第6/12个月：应检测HBeAg和抗HBe抗体以及血清HBV DNA水平 ； 2.在随访期间通过实时PCR检测不到HBV DNA是最佳的结果，因为与HBsAg消失这一显著变化有关; 3.如HBV DNA检测不到，在抗HBe血清学转换之后，应每间隔12个月检测HBsAg ; HBeAg阴性患者 ： 1.在治疗的第6/12月与治疗后的第6/12个月：应检测血清HBV DNA水平；
10、 2.通过实时PCR检测不到HBV DNA是理想的期望持续治疗后应答 ; 3.如HBV DNA仍然检测不到，应每间隔12个月检测HBsAg ;,摘自2012年EASL临床实践指南：慢性乙肝病毒感染管理,2. 监测治疗,高灵敏度检测方法在治疗中的应用,以NAs为基础的治疗 HBeAg阳性患者NAs有限疗程治疗: 1.应每6个月检测HBeAg和抗HBe，在治疗期间每3-6个月通过敏感的PCR方法检测HBV DNA; 2.抗HBe血清学转换之后，应每间隔12个月检测HBsAg NAs长期治疗： 1.理想上，应达到HBV DNA下降至实时PCR检测不到的水平（即低于1015 IU/ml）以避免耐药，因
11、而HBV DNA监测是检测治疗失败的关键; 2.在第3个月时应检测HBV DNA水平以查明病毒学应答情况，然后每3-6个月检测。,摘自2012年EASL临床实践指南：慢性乙肝病毒感染管理,2. 监测治疗,高灵敏度检测方法在治疗中的应用,3. P区耐药监测和判断条件,高灵敏度检测方法在治疗中的应用,抗病毒治疗后HBV从病毒变异到临床耐药,原发无应答,病毒学（部分）应答,临床耐药,乙型肝炎病毒YMDD突变检测 乙型肝炎病毒1896/1762/1764位点变异检测 HBV P区药物敏感位点基因突变检测(11位点) HBV preC区/C区基因突变位点检测(8位点两个区段) HBV preS区/S区基
12、因突变位点检测(4位点两个区段),艾迪康开展乙肝耐药及基因突变检测,小结,1. 高灵敏度乙肝DNA检测： 罗氏Cobas/磁珠法：灵敏度高、线性范围广，检测结果准确，满足国际标准。 2. P区耐药：用药无进展或治疗效果反弹，考虑检测P区耐药。,高灵敏度丙肝RNA检测,病毒学应答的检测及定义,摘自2012年EASL临床实践指南：丙肝病毒感染管理,高灵敏度丙肝RNA检测,治疗开始第4周、12周和24周进行血清病毒载量测定有助于调整治疗方案；（这些时间点发生HCV RNA病毒消失直接与SVR呈正比 ） 必须要进行治疗结束后病毒学应答和治疗结束24周的SVR评估； 非合并肝硬化而达到SVR患者，治疗后
13、48周和96周要检测ALT和HCV RNA，以确保ALT正常同时血清病毒呈阴性； 可能出现疾病复发：患者达到了治疗结束时的病毒学应答(治疗结束时血清 HCV RNA病毒未检出)，但是随后病毒学指标恶化，未达SVR。 标准治疗方案的复发率介于15%-25%，数值的变化取决于治疗期间HCV RNA转阴时间。,摘自2012年EASL临床实践指南：丙肝病毒感染管理,诊断与监测治疗,高灵敏度丙肝RNA检测,“应选择灵敏的检测法进行HCV RNA定性和定量检查(检测限的低限值50IU/ml)，理想的病毒学检测方法是RT-PCR法，检测结果的单位应为IU/ml。”,EASL（欧洲肝脏研究学会）指南1,“治疗
14、HCV感染的期望临床终点是清除病毒，即采用最敏感的方法也无法检测到血清HCV病毒RNA，因此实验室内部检测应采用real-time PCR的方法对病毒进行检测”,APASL（亚太肝脏研究协会年会）标准2,高灵敏度丙肝RNA检测,数据来源：北京大学人民医院,高灵敏HCV RNA检测更准确，国产普通检测较容易造成错误治疗决策。,RVR：快速病毒学应答 cEVR：完全早期病毒学应答,高灵敏度丙肝RNA检测,高灵敏度HCV-RNA检测：灵敏度高，不会造成停药过早，导致复发率高,高灵敏度丙肝RNA检测,基因分型,乙肝基因分型（建议做）,2012年EASL临床实践指南：慢性乙肝病毒感染管理指出：与HBV基
15、因型为D和C比较，基因型为A和B的抗HBe血清学转换率与HBsAg消失率更高 ; 2010年中国慢性乙型肝炎防治指南更新版指出：HBV基因型和疾病进展和干扰素治疗效果有关。与C基因型感染者相比，B基因型感染者较早出现HBeAg血清学转换，较少进展为慢性肝炎、肝硬化和原发性肝细胞癌。,乙肝基因分型,EASL（欧洲肝脏研究学会）指南1,“HCV RNA基因分型结果有助于判定治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的个体化方案。治疗前应进行HCV RNA基因分型和血中HCV RNA定量，以决定抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的剂量”,中国（丙型肝炎防治指南）标准2,“HCV患者持续病毒学应答（SVR）的最佳预测因子
16、为IL-28B基因多态性、基因型及肝纤维化分期。”,丙肝基因分型（必须做）：1.决定治疗路线；2.决定用药剂量。,丙肝基因分型,基因1型（包括4型）患者 病毒应答指导的抗病毒治疗,摘自2012年EASL临床实践指南：丙肝病毒感染管理,基因2/3型（包括5/6型）患者 病毒应答指导的抗病毒治疗,丙肝基因分型,不同基因型所用利巴韦林剂量不同：,摘自2012年EASL临床实践指南：丙肝病毒感染管理,低应答因素：胰岛素抵抗、代谢性综合征、严重肝纤维化或肝硬化、老年感染患者,丙肝基因分型,总结,1. 高灵敏度检测乙肝DNA、丙肝RNA： 进口：罗氏Cobas 国产：磁珠法 2. P区耐药 3. 基因分型： 乙肝基因分型（建议做） 丙肝基因分型（必须做）,THANKS!,
