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1、孛匡誊牧兽医学会动物繁殖学分会第+ 三滏学本爨毒寸会论文集 影响奶牛活体采卵效果的主要因素研究 麻柱1 吴胜权2 张瓤慧2 薛建华2 宣柏华2 孙凤俊2 桑润滋协 ( 1 河北农业大学动物科技学院，保定0 7 1 0 0 l ；2 北京奶牛中心，北京1 0 0 0 8 5 ) 捅裴通过对奶牛活体采卵( O v u mP i c k - u p ，O P U ) 技术( B 超导引法) 进行研究，探讨了不同 采卵负展、不同采卵间隔以及采卵前F S H 处理对O P U 效果的影响。结果表明：采用1 1 0 m m H g 负压采 卵效果较好，每头次可以获得6 9 枚帮母细胞，霹收率为6 6 0
2、3 ，优震努母细胞率为6 8 8 毒；以2 次w 的采卵阏隔进行O P U ，每头次获卵5 。2 9 1 。1 9 枚，薅收率6 8 。6 1 4 。1 9 ，乎均2 次w 比1 次 w 、1 次2 w 可获得更多的卵母细胞；O P r d 前对供体牛用F S H 处理，头均穿刺1 2 3 6 土2 3 9 次，头均 获卵8 6 士1 8 5 枚，均显著高于对照组，但回收率、优质卵母细胞率、卵裂率扣桑囊率与对照组差 异不显著。 关键词活体采卵；体外受精；卵母细胞； 应用O P U 技术可以反复获得遗传价值较高的良种母牛大爨优质卵母细胞，通过体外受精后可以 获得大量遗传系谱明确的胚胎，从而更加充
3、分地挖掘母牛的遗传潜力，缩短世代间隔，加速遗传进 展。1 9 8 8 年，荷兰的P i e t e r s e 善先利髑超声波技术( B 超) 通过子富壁从活体牛饔巢采到穿母细胞。 之后，圈内外很多学者对该技术进行了大量研究。尽管O P U 技术日趋完善，但依然存在着效率低的 问题，主要表现在获卵数少、回收率低。另外反复进行O P U 对供体牛生产和繁殖机能有无影响还没 有得舞一致豹结论。本文研究了不同采郛受压、不弱采卵时间闯隔以及采卵前F S H 处理对O P U 效 果的影响，鐾在进一步提高O P U 效率，使之更有效地应用于胚胎的体外化生产和转基因、核移植等 科学研究。 1 材料与方法
4、1 1 实验动物 供体母牛选自北京奶牛中心良种场。选择萤莽状况良好、繁殖机能正常且无其它疾病，年龄3 _ 7 岁的健康母牛进行重复活体采卵实验。 1 2 实验仪器 S S D 9 0 0 型活体采卵仪( 日本，A L O K A 公司生产) ，包括图象显示器、7 5 M I - h 扇形扫接探头、 负压泵、恒温槽、持针器、采卵针( 均为1 8 G ) 和脚踏开关等。另外还需要胚胎过滤器、卵泡液收 集管、培养瓶、体视显微镜、恒温操作台、c 0 2 培养箱等。 1 3 试刿 采卵液：P B S + 0 5 血清+ l O I U m l 肝素+ 双抗；卵母细胞成熟培养液： T C M 1 9 9
5、+ l O F C S + F s H + E 2 + a b ；受精液：I V F - 1 0 0 ( 日本清化机能研究所) ；受精卵体外发育培养液： T C M 1 9 9 + B S A + P y r u v a t e + a b ，添加胰岛素转铁蛋自。硒；另外需要F S H 激素( 薪涯兰，I C P 公司生 产) 、盐酸普鲁卡因、耦合剂、新洁尔灭等。 1 4 实验方法 1 4 1 舞母细胞黔采集 作者简介：麻柱，1 9 7 8 年出生，硕士 搴：通讯作者 中隧畜牧兽瞧学会动物繁殖学分会第十纛篪学术研讨会论文集 采卵操作前先用2 - - 4m l 盐酸普鲁卡因对供体牛进行尾椎硬膜外
6、麻醉，麻醉要充分，否则直肠 的努责影响采卵。当供体牛尾部完全放松，自然下垂时表示麻醉充分。然后清除宿粪，用浓度为0 ，5 的薪洁尔灭消毒水清洗磐酲。把装有采卵液的离心管和集郛杯置于恒滠槽上，将集卵杯分别与负压 泵和穿刺针连接，然后先往集卵杯内抽吸少量采卵液以湿润其内壁，采卵管内也要充满采卵液。采 卵前将持针器与超声波探头固定在一起，探头表西涂抹耦含剂；只手将带有持针器的超声波探头 插入蘸道至鬻道穹隆处，另一只手通过盔肠把握卵巢，将卵巢隔着鬻道壁皓于探头之上。超声波探 头要充分深入，否则在固定卵巢时容易损伤卵巢的连系组织。穿刺前助手协助将穿刺针插入持针器。 操作者根据屏幕显示图像调整探头与卵巢的
7、相对位置，使卵泡位于进针线上，此时开启真空泵并攘 进穿刺针对郛泡进行穿刺。充分抽吸后的卵泡腔将发生凹陷并呈现与周围组织相同的灰自色。采卵 过程中，血液凝固容易阻塞采卵针，此时要将穿刺针撤出，抽吸离心管内采卵液来疏通采卵管。确 认所有卵泡抽吸完全后，冲洗穿刺针及糨连的导管，以确保弗母细胞进入集郛棒。同样盼方法对另 一侧卵巢进行采集。 1 4 2 卵母细胞的检查和鉴定 将收集管内卵泡液完全转移到胚胎过滤器，雳预热的采卵液反复冲洗胚胎过滤器蠹的舞泡液， 逝至清澈为止。留下适量含有卵母细胞的卵泡液，在体视显微镜下捡嬲卵子，用成熟培养液洗涤2 遍后进行鉴定分级。依据卵母细胞胞质均匀程度和卵丘细胞层数及完
8、整性将卵母细胞分为4 级：A 级，胞质均匀，卵丘细胞完整虽3 层以上；B 级，胞质均匀，卵丘细魔1 2 层或不完整；C 级，胞 质不均匀，卵丘细胞不完整；D 级，胞质不均匀、裸卵或老化的卵母细胞；A 、B 级卵为可用卵。 1 4 3 体外成熟、体外受精和体外发育 将可用麴郛母细胞焉采卵液洗涤1 次，再用成熟培养液洗涤3 次藤，移入预先在培养薇平衡忿 的卵母细胞成熟液中，3 9 U 、5 C 0 2 、饱和湿度的条件下成熟培养2 2 h 。之后，用I V F 1 0 0 液制作 5 0nl 的受精小滴，并预平衡2 h 。取细管冻精解冻后用I V F 。1 0 0 稀释，在2 0 0 0 转离心洗
9、涤两次，并 调整糟子密度。然屠淘受精奎演中鸯羹入约5 0 l al 处理好静精予，使精乎最终浓度约力l 1 0 64 “ m l 精子。将体外成熟的卵母细胞用受精液洗涤3 次，移入受精小滴中，每滴放l O 枚卵母细胞。精卵在 培养箱中共培养6 h 后取出，用发育液洗涤3 次，吹打去掉部分卵丘细胞，移入预平衡好的发育液中 进行培养。 2 结果与分析 2 。薹不霹采舞受压对O P U 效果的影响 采用不同采卵负压( 7 0 m m H g 、9 0 m m H g 、1 1m H g 、1 3 0 m m H g ) 对4 头健康母牛进行2 次， 周O P U ，探讨不同采卵负压对获卵数、回收率和
10、卵母细胞质量的影响。 表不隅采舞受矮对郓母纲脆霾收率瑷及羚子蒺量静彩鹬 T a bIe1T h ee f f e c t so fdif f e r e n ta s pir a tiO Rp r e s s u r e so no o c y t e sq u aI it ya n dr e c o v e r yr a t e i 采卵负压O P U 次数头均穿刺头均获卵 回收率( )A 、B 级卵母细胞率( ) 同酬内肩标不同小写字母表示差异显著( P O 0 5 ) ，肩标不同犬写字母表涿差异极显蒋( P 0 0 1 ) ，下表同。 V a l u e sw i ld i f f e
11、r e n ts u p e r s c r i p t si nas a m ec o l u m na r cs t a t i s t i c a l l yd i f f e r e n t ( a - e ：P 0 0 5 ，A ，C ：P 0 0 1 ) 结果显示：头均穿刺数各组闻差异不显著；7 0 m m H g 负压下的头均获卵数( 4 。3 5 2 0 3 ) 显著 低于其它各组( R ，o 0 5 ) ，其它各组闯差辩不显著；7 0 m m H g 负压下的豳收率显著低于1 1 0 m m H g 、 1 3 0 m m H g 组( P 0 0 1 ) ，1 1 0 m
12、m H g 、1 3 0 m m H g 负压下的回收率之间差异不显著( 6 6 0 3 v s6 7 2 9 ) ， 但均显著高于9 0 m m H g 组( P o 。0 5 ) 。说姨采卵负题的变化不影响可穿刺郛泡的数量，但是影响每 头次的获卵数和回收率。负压越低，头均获卵数越少，回收率也越低；负压越高，头均获卵数越高， 孛霉喜牧兽蓬学会动物繁殖学分会第十兰屡学寒研讨会论文集 回收率也越高。1 3 0 m m H g 负压下的A 级、B 级卵母细胞率( 4 8 6 l ) 显著低予其它各组( P O 0 5 ) ， 其它各组闻差异不显著。说暖1 3 0 m m H g 负压已经对卵丘细胞
13、造成了侥害。采卵负篷不可过离，否 则破坏卵丘细胞，造成卵子质量下降。 2 2 不同采卵间隔对O P U 效果的影响 选择1 6 头健康成年母牛，随机分成三缝，鲻隔3 d 、7 d 、1 4 d 进行重复O P U ，探讨不同采卵时 间间隔对获卵数和姻收率的影响，结果见表2 。 袭2 不同采卵时间间隔对卵母细胞回收率的影响 T a b le2T h ee f f e c t so fdif f e r e n t0 P Uin t e r v aIso no o c y t e sr e c o v e r yr a t e 闼隔3 d 进行O P U ，头均穿剩数( 7 7 l l 。5 1
14、) 、头均获卵数( 5 2 9 1 1 9 ) 均显著低于其它各缝 ( P O 0 5 ) ；回收率为6 8 6 l 4 。1 9 ，显著高于其它备组( p o 。0 5 ) 。说明间隔3 d 反复进行O P U ， 虽然每次O P U 可穿刺卵泡数和获卵数减少，但是在一定时期的获卵总量上，间隔3 dO P U 比间隔7 d 、 1 4 da I P U 可获得较多数量的卵母缁脆( 1 0 5 8 枚触) 。 2 3 采卵前F S H 处理对O P U 效果的影响 选择1 3 头健康成年母牛，间隔7 d 连续进行5 次O P U 。其中9 头在采卵前4 8 h 和3 6 h 给供体牛 分另l
15、注射4 c c F S H ，总剂量8 c c ( 约1 4 0 I U ) ，与对照组( 4 头，未处理) 比较，探讨F s 珏处理对获卵 数、回收率、卵母细胞质量以及体外受精效果的影响，结果见表3 、表4 。 表3 采卵前F S H 处理对O P U 结果的彰响 T a b l e3T h ee f f e c t so fF S Hs t i m U l a t i o no f fO P Ur e s u l t s F S H 组头均穿蒯数( 1 2 3 6 2 3 9 ) 、头均获卵数( 8 6 l 。8 5 ) 均显著高于对照组( P O 。0 5 ) ，网 收率两组间差异不显著
16、。说明F S H 处理后可以提高头均获卵数，但不影响卵子回收率。 表4 采郛蓠F S H 处理对鲳母纲脆矮爨瑷及受精藤体羚发弯麓彩晌 T a b I e4T h ee f f e c t so fF S Hs t i m u I a t i O f fO f fo o c y t e sq u a Ii t ya n ds u b s e q u e n td e v e I o p m e n t F S H 组A 、B 级卵母细胞率、卵裂率、桑囊发育率差异均不显著。说明F S H 处理可以提高可用 卵子数量，但并不影响卵母细胞瘊量和受精后的翠期题胎体并发育。 3 讨论 3 1 采郛负压对O P U 的影嘲 O P U 过穰中真空泵压力和穿刺针的型号影响卵母细胞回收率和质量。H a s h i m o t oe ta l ( 1 9 9 9 ) 研究表明，使用2 1 G 针头、8 0 m m H g 负压的A 、B
