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1、分类号 密级 华中农业大学硕士学位论文 影响牛体外受精若干因素的研究 及性控精液体外受精初探 】838673 S T U D Y O NS E V E R A LF A C T O R SI N F L U E N C I N GO N I NV I T R OF E R T I L I Z A T I O N O FB O V I N E A N DS E X - S O R T E DS E M E N I NV I T R OF E R T I L I Z A T I O N 研究生：穆春雨 指导教师：易建明教授 专业：动物遗传育种与繁殖研究方向：动物生殖生理与生物技术 获得学位名称：农
2、学硕士 获得学位时间：2 0 0 7 年6 月2 6 日 华中农业大学动物科技动物医学院 二o o 七年六月 本课题由 湖北省重大科技攻关项目( 2 0 0 6 A A 2 0 5 A 0 3 ) 资助 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 老 如需保密，解密时间 2 oto 年易月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同-
3、r _ 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生始槠帝 帆妒7 年舌月厂孑日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须按 照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇 编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论 文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学位论文作者张懒导师始易嘉哆 签名日期：妒1 年舌月伊 签名日期：如口1 年( 月? 形日 注：请
4、将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 影响牛体外受精若干因素的研究及性控精液体外受精初探 目录 中文摘要。i A b s t r a c t ：i j I i 缩略语表V i 前言1日U 百 1 文献综述1 1 1 体外受精技术发展概况1 1 2 卵母细胞的体外成熟培养2 1 2 1 卵母细胞的主要来源2 1 2 2 影响卵母细胞的体外成熟的因素2 1 2 3 卵母细胞体外成熟的判定6 1 3 卵母细胞的体外受精6 1 3 1 精子的获能现象6 1 3 2 精子的体外获能6 1 3 3 精子获能的判定8 1 3 4 影响精子体外受精效果的因素8 1 4 影响早期胚胎体外发育的因素1 0 1
5、 4 1 培养液1 0 1 4 2 培养体系。1 3 1 4 3 小结1 5 1 5 展望1 5 2 研究目的与意义1 6 试验研究1 7 3 材料与方法1 7 3 1 试验设备1 7 3 2 主要试剂。1 7 3 3 操作液1 8 3 3 1 采卵液1 8 3 3 2 卵母细胞成熟培养液1 8 3 3 3 精子洗涤液：。1 8 3 3 4 精子获能液：1 8 3 3 5 胚胎体外培养液：1 9 3 4 试验方法1 9 3 4 1 卵巢的收集与保存。1 9 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 3 4 2 卵母细胞采集。1 9 3 4 3 卵母细胞的筛选与分级1 9 3 4 4 卵母细胞
6、成熟培养1 9 3 4 5 颗粒细胞单层( G C M ) 制作2 0 3 4 6 卵母细胞成熟判定2 0 3 4 7 精子的体外获能2 0 3 4 8 卵母细胞体外受精。2 0 3 4 9 受精卵体外发育培养2 1 3 5 试验方案：2 1 3 6 试验设计2 1 3 7 统计学分析2 2 4 结果与分析。2 3 4 1 卵巢低温保存对卵母细胞体外成熟的影响2 3 4 2E G F 对卵母细胞体外成熟的影响2 3 4 3 不同种公牛精液对体外受精效果的影响2 4 4 4 不同的受精获能液和精子处理方法对体外受精效果的影响。2 4 4 5 不同的培养体系对牛I V F 胚胎体外发育的影响2 5
7、 4 6 母牛不同年龄对卵母细胞体外成熟及体外受精的影响2 6 4 7 性控精液不同处理方法对体外受精效果的影响2 6 4 8 性控精液与常规精液对体外受精效果的影响2 7 5 讨论j ：1 8 5 1 卵巢低温保存对卵母细胞体外成熟的影响2 8 5 2E G F 对卵母细胞体外成熟的影响2 8 5 3 不同种公牛精液对体外受精效果的影响。3 0 5 4 不同的受精获能液和精子处理方法对体外受精效果的影响。3 0 5 5 不同的培养体系对胚胎体外发育的影响3 1 5 6 母牛不同年龄对卵母细胞体外成熟及体外受精的影响3 2 5 7 性控精液不同处理方法对体外受精效果的影响3 3 5 8 性控精
8、液与常规精液对体外受精效果的影响3 4 6 结论。3 5 参考文献3 6 j 变谢4 6 附录试验照片4 7 影响牛体外受精若干因素的研究及性控精液体外受精初探 中文摘要 本试验的目的是通过研究卵巢保存温度、精子获能方法、胚胎体外培养体系等 方面来探讨诸因素对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响，进一步完善胚胎体外 生产体系；在此基础上，把性别控制技术与体外受精技术相结合，把建立起来的胚 胎体外生产体系应用于性控精液体外受精的初步研究，探讨用性控精液体外受精生 产体外性控胚胎的可行性。 主要研究结果如下： 1 把卵巢随机分成两部分，一部分放到3 7 左右的D P B S 中保存做对照，另 一部分
9、则放到4 左右的D P B S 中，各保存8 h 后，收集卵母细胞进行体外培养，研 究卵巢保存温度对卵母细胞体外成熟的影响。结果发现卵巢经4 保存8 h 后卵母细 胞的成熟率急剧下降，与对照组之间存在显著差异( 1 2 1 2 V S6 8 5 2 ) ( P 0 0 5 ) ；添加5 0 n g m L ( 7 4 3 9 ) 与7 5 n g m L E G F ( 7 5 8 6 ) 组问的成熟率无显著差异伶0 0 5 ) ，但均显著高于对照组与2 5 n g m L E G F 组( P o 0 5 ) 。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 5 卵母细胞体外受精后，将受精卵随
10、机分成四组，以T C M l 9 9 和S O F 为胚胎 基础培养液，分别用( 1 ) T C M l 9 9 、( 2 ) T C M l 9 9 + G C M 、( 3 ) m S O F 和( 4 ) m S O F + G C M 四种培养体系进行体外培养，筛选合适的胚胎体外培养体系。研究结果显示各 组之间卵裂率无显著差异( P 0 0 5 ) ，但囊胚率上出现了明显的差异俨 0 0 5 ) 。 6 从屠宰场分别采集初情期前的小母牛和成年母牛的卵巢，保存在3 7 的 D P B S 中运回实验室。采集卵母细胞后进行体外成熟培养和体外受精实验。不同年 龄的牛( 小母牛和成年母牛) 的卵母细胞体外成熟效果无显著差异( 7 3 7 5 v 5 7 5 8 0 ) 俨 0 0 5 ) ，来源于小母牛卵巢组的卵母细胞成熟培养后的卵裂率与成年母 牛组间无显著差异( 6 6 1 3 v s6 8 4 8 ) 俨 0 0 5 ) ，而囊胚率存在明显差异( 1 6 9 8 v s3 7 7 2 ) 俨 0 0 5 ) ，b u tt h e yw e r eb o t hs i g n i f i c a n t l yh i g h e r ( P 0 0 5 ) 5 A f t e r Ep
