影响猪体细胞克隆胚胎生产效率因素的研究

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1、中国农业科学院 硕士学位论文 影响猪体细胞克隆胚胎生产效率因素的研究 姓名：刘晓 申请学位级别：硕士 专业：动物遗传育种与繁殖 指导教师：杨博辉;潘登科 20080601 摘要 猪的体细胞克隆在农业和医学领域具有巨大的应用前景，尤其体现在作为研究人类疾病的动 物模型、人类异种器官移植方面。本研究利用屠宰场猪卵巢，对体细胞克隆胚胎生产中的一系列 相关因素进行研究，为转基因克隆猪的生产奠定了基础，结果如下。 不同时间段添加外源激素对猪卵母细胞体外成熟的影响：猪卵母细胞以 N C S U 2 3 + 1 0 p F F + 1 0 I U m L P M S G + 1 0 I U m L h C

2、G + 1 0 n g m L E G F 为成熟液体外培养4 4 h ：前2 2 h 在 培养液中添加激素，后2 2 h 不加激素以及添加激素连续培养4 4 h 。结果发现：后2 2 h 去除激素显 著提高了孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率( P 0 0 5 ) 。这与W e l l s 等( 1 9 9 9 ) 的研究结果相一致；而R o hS 等研究了早期体细胞( 8 1 6 代) 和晚期( 1 7 3 2 代) 对核移植后囊胚发育率的影响( 1 8 9 0 0 慨1 0 5 ) ，认为早期体细胞更易于重编程。本试验中用的是五代左右的细胞。 4 中用农、j j ! ? 学甍硕 j 学p 论文第一

3、寺引言 I III II I 1 2 3 融合激活方法的研究进展 细胞核移植有两种操作程序：一种是胞质内注射法，另一种是电融法，后一种方法是目前动 物细胞核移植研究中普遍采用的操作程序，即把整个供体细胞放至去核的受体卵周隙内通以直 流电脉冲使两者融合。因为这种方法具有操作简便、对卵母细胞损伤小等许多优点。 电融合受到如融合液、融合仪等许多因素的影响，本实验室用的是美国的B T X E C M 2 0 0 1 电 融合仪。融合液0 1 m M 的C a 计。 在体细胞克隆过程中，胚胎的发育需要重构胚的充分激活。电激活是猪S C N T 中最常用的方 法，其原理就是在瞬时高压直流电脉冲的作用下，细

4、胞膜被击穿，使卵母细胞上生成可逆性的微 小的孔洞，细胞内外的离子和大分子物质发生短暂性的流动，胞质内c a ：+ 升高( 田见晖等，2 0 0 4 ) ， 升高的C a 2 + 一方面破坏了已存在的C S F ，使M P F 活性下降，另一方面引起对C a 2 + 敏感的周期蛋 白的降解，从而导致M P F 水平下降或消失，引起卵子活化，促使卵母细胞离开M I I 期，完成减 数分裂，从而激活卵母细胞。电脉冲引起的微孔大小受脉冲强度、时间和脉冲次数的影响( 张德 福等，2 0 0 1 ；刘国世等，2 0 0 4 ) 。 但是，采用单纯电刺激激活的卵母细胞孤雌胚胎大多为单倍体，发育能力不强。因此

5、，为了 提高孤雌激活胚胎的发育率，常常将电刺激与化学激活联合起来，I m 等研究电激活后辅助的化 学激活降低了凋亡率而且提高了发育能力。T a o 等研究证实，以电脉冲结合6 D M A P 激活重构 胚，可提高其发育至囊胚的能力。 1 2 4 体细胞克隆胚胎的重新程序化 虽然体细胞克隆在许多物种中获得了成功，但克隆的效率非常低。不论是用E S 细胞还是体 细胞的克隆都可能出现一些表型方面的异常：包括呼吸和循环系统的问题；即使是健康存活的个 体，也可能有免疫缺陷或肾、脑的功能缺损；大多数的克隆动物出生时有超重现象。克隆效率是 影响体细胞克隆技术应用的最大障碍，核移植后几小时内发生的供体核的分子

6、重排事件，则决定 了克隆胚胎的命运( 李世杰等，2 0 0 4 ) 。 目前认为：供体核的不完全重编程是导致克隆效率低的主要原因。在体细胞克隆中，供体核 来自高度分化了的体细胞。在分化过程中，体细胞核获得了高度特异的D N A 和染色质的表观遗 传修饰( e p i g e n e t i cm o d i f i c a t i o n ) ，这些修饰导致了分化状态的细胞记忆。由于供体核支持克隆胚胎 的发育，所以当供体细胞核被移入去核的卵细胞后，供体核必须经过这些表观遗传修饰的重编程 ( r e p r o g r a m m i n g ) ，激活对胚胎早期发育有重要作用的基因，并抑制与分

7、化相关基因的表达，从而 获得发育的全能性( H u m p h e r y se t 讲，2 0 0 2 ) 。供体核的不完全重编程，导致在发育过程中有重 要作用的基因没有表达或异常表达，是克隆效率低的主要原因( D a n i e l se t a l ，2 0 0 0 ) 。 关于供体核的重编程，目前研究主要集中在D N A 甲基化( D N Am e t h y l a t i o n ) 、组蛋白乙酰化 ( h i s t o n ea c e t y l a t i o n ) 。形成了一个新的热点表观遗传学( E p i g e n e t i c s ) ，它们对于早期胚胎和配子

8、 形成和发育、组织特异性基因的表达、大部分基因沉默都起着关键作用。表遗传修饰是指不可改 变D N A 序列的可逆性修饰，是相对于遗传性修饰而言的。 D N A 甲基化是基因组的主要表观遗传修饰方式，对基因转录起抑制作用，是调节基因组功 能的重要手段。分化体细胞的甲基化形式是稳定的和可遗传的。然而在哺乳动物中，至少需要有 5 中用农、J k 科学院硕七学伊论文第一节引言 两个发育阶段( 生殖细胞和植入前胚胎) ，其甲基化的形式在基因组范围内发生重编程，从而产生 具有发育潜能的细胞( L ie t a l ，2 0 0 2 ) 。 D N A 甲基化是指D N A 序列中的C p G 岛中的胞嘧啶

9、发生甲基化，从而决定基因的表达与否 ( R e i ke la 1 ，2 0 0 1 ) 。C p G 岛( C p Gi s l a n d ) 是基因组中富含C G 的一段短的D N A 序列，在细胞分 化的过程中，基因的甲基化状态将遗传给后代细胞。生物体通过这种形式实现了含有相同D N A 序列的体细胞表达不同的基因，行使不同的功能( 毕春明等，2 0 0 3 ) 。甲基化的D N A 被特异性的 抑制性蛋白识别，这些蛋白与转录共抑制因子通过对核小体中组蛋白N 末端的去乙酰化作用抑制 转录活性，D N A 甲基化对印迹基因的稳定抑制及雌性哺乳动物x 染色体的失活均有重要作用( 肖 文伍等

10、，2 0 0 3 ) 。 哺乳动物胚胎早期发生的重编程是非常保守的，而体细胞克隆所用的供体细胞，如胎儿和成 年成纤维细胞、胚胎干细胞以及其他类型的高度分化的体细胞中，基因组具有较高的甲基化水平， 具有体细胞的典型特征。在正常牛的胚胎中，基因组从受精卵开始发生主动去甲基化，甲基化水 平在8 细胞胚胎进一步降低，一直持续到1 6 细胞的胚胎，这时胚胎发生重新从头甲基化。在克 隆牛植入前的胚胎中，发现了基因组重复序列异常的甲基化状态。K a n g 等人( 2 0 0 2 ) 通过对单 个着床前克隆胚胎分析发现，单拷贝序列去甲基化，而卫星序列未去甲基化，还发现I C M T E 比 率与甲基化水平成

11、反比，T E 上的甲基化紊乱造成胚外组织广泛的基因功能失调，致使胎盘结构 异常。这是由于在克隆牛的胚胎中，当供体成纤维细胞核被移入去核的卵母细胞后，基因组发生 了一些去甲基化( 主动去甲基化的影响) ，但是在随后的发育中没有发生进一步的去甲基化，而是 过早的重新从头甲基化( D e a n e t a l ，2 0 0 1 ) 。克隆猪胚胎的遗传重编程与正常的小鼠胚胎相同， 但与克隆牛胚胎不同，克隆猪胚胎移植前阶段，卫星D N A 序列和P R E I S I N E 序列表现为主动去 甲基化的过程，与内源性去甲基化过程相似，而克隆牛胚胎整个囊胚时期都保持高甲基化状态。 有研究似乎也表明：猪克

12、隆囊胚不出现高度的异常甲基化模式，可能跟其胚胎在体外培养时间短 有关( 一般在8 c e l l 期前移植) 。 组蛋白在进化上十分保守。真核生物的染色体上主要含有5 种组蛋白，即核心组蛋白H 2 a 、 H 2 b 、H 3 、H 4 及连接组蛋白H 1 。核心组蛋白八聚体( H 2 a ，H 2 b ，H 3 ，H 4 各两分子组成) 、连接组 蛋白H l 和1 5 0b p 的D N A 共同组成了染色体的基本单位一核小体。 D N A 与组蛋白是染色质的主要成分。染色质结构与基因活性密切相关，通过组蛋白乙酰化 和去乙酰化来修饰染色质的结构。在D N A 复制、基因转录及细胞周期的调控等

13、方面有重要作用。 组蛋白乙酰化松弛染色质，与转录活化正相关；脱乙酰化则和转录抑制相关。 在哺乳动物个体发育过程中，不同组织的细胞根据其功能的需要，只表达其基因组中的特定 类型的基因，基因表达与否以及表达程度受到严格控制。动物机体内的每类细胞都具有自己不同 的表观遗传修饰标记，对于大多类细胞来说，它们一旦分化成功，这些表观修饰就会变得稳定， 将随D N A 的复制和细胞的分裂而稳定地遗传下去，称为“细胞记忆”，然而在正常胚胎发育早期 或生理变化情况下，细胞基因组会发生大规模表观重序来抹除原来的修饰状态，从而建立一套新 的修饰状态。克隆动物发育过程中，移植到卵母细胞内的高度分化体细胞必须发生大规模

14、的表观 重序从而转变成为全能性细胞。O l g a 等人研究了小鼠胚胎发育期间组蛋白修饰动态变化，试图发 现与D N A 甲基化一样的规律，以解释组蛋自修饰也是合子基因组重序过程中需要抹除的一种表 观修饰标记，结果表明组蛋白修饰存在稳定和动态变化的修饰状态。 6 中同农、l p 科学甍硕卜学p 论文第帝引吉 E n r i g h t 等( 2 0 0 3 ) 用一种组蛋白去乙酰化抑制剂( T S A ) 处理供体核发现，用组蛋白去乙酰化 抑制剂T S A 处理可以提高囊胚率；用另一种组蛋白去乙酰化抑制剂丁酸钠( N a B u ) 处理供体细胞 核，得到了同样的结论( S h ie t a

15、l ，2 0 0 3 ) 。以上研究表明，体细胞克隆胚胎中，组蛋白乙酰化的 重编程可能是不完全的，组蛋白去乙酰化抑制剂的加入可以促进供体细胞的重编程。 1 3 本研究的目的 由于猪的体细胞克隆的巨大应用前景，已成为体细胞克隆领域的研究热点。本研究以建立高 效的核移植体系，达到大量地生产克隆胚胎为目的，从而为进一步进行转基因猪的生产奠定基础。 7 中曰农、f p 科学甍五更 j 学伊论文第r 二亭试验部分 ! 罡皇曼! 曼曼! 皇曼! 鼍! 曼! 黑曼I I ! 皇曼鼍曼兰! ! 寡一一一一I I I 曼曼曼曼曼曼曼曼舅 第二章试验部分 2 1 激素作用时间对卵母细胞成熟的影响 卵母细胞的成熟过

16、程就是卵母细胞的获能过程，这一获能过程包括恢复减数分裂并进入到第 二次减数分裂中期的核成熟和经历一系列复杂生理生化变化的细胞质的成熟。如何调节诸方面的 因素达到细胞质和细胞核共同成熟，提高成熟率是卵母细胞体外成熟的关键性问题。猪卵母细胞 体外成熟的时间较长，一般为4 2 “ - 4 4 h ，这其中促性腺激素的添加对于成熟的启动起着非常重要 的作用，在猪卵母细胞体外成熟研究中，大多学者都选择添加促性腺激素P M S G 和h C G 。 孤雌生殖( p a r t h e n o g e n e s i s ) 是用化学或物理刺激代替精子的作用诱发卵母细胞激活、进行 有丝分裂、形成胚胎的繁殖过程，孤雌胚胎为体细胞克隆胚生产条件的探索提供了比较合适的模 型，同时孤雌激活的研究为发育生物学、胚胎工程的研究提供了理论依据。 本试验以孤雌激活胚胎为研究对象，对整个过程中激素的作用时间进行了比较研究，以获得 更多优质的卵母细胞，为体细胞核移植提供材料。 2 1 1 材料与方法 2 1 1 1 主