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1、第2 5 卷增刊 2 0 0 6 年1 1 月 分析测试学报 F E N X IC E S H IX U E B A O ( J o u r n a lo fI n s t r u m e n t a lA n a l y s i s ) V o I - 2 5 N O V 2 0 0 6 弱阳离子交换毛细管液相色谱整体柱 的制备及其对蛋白质的分离 马继平1 ，郑睿2 ，丁明玉2 ( 1 青岛理工大学环境与市政工程学院，山东青岛2 6 6 0 3 3 ；2 清华大学化学系，北京1 0 0 0 8 4 ) 毛细管液相色谱柱具有节省样品、流动相，固定相消耗少，提高检测灵敏度等优点。近年来， 随着蛋
2、白组学的发展，毛细管离子交换液相色谱受到重视。目前蛋白组学中占有重要地位的多维液相 色谱一质谱联用技术中，第一维液相色谱大多采用毛细管离子交换色谱柱【2 】。目前采用的颗粒填充毛 细管柱柱压较高，易被蛋白质污染，且价格昂贵，使用寿命短。整体柱【3 1 具有大孔结构，柱背压低， 对流传质使传质速率加快，制备过程简单，由于溶质与基质的接触时间短，降低了生物样品失活的可 能性。与强阳离子交换固定相相比较，弱阳离子交换固定相与生物分子的相互作用比较温和，因此不 易发生蛋白质变性现象。目前报道的弱阳离子交换整体柱通常采用两步法改性【4 】：先用乙二胺处理， 再用氯乙酸反应。我们在选取的具有良好刚性和渗透
3、性的整体固定相上，利用亚胺乙二酸进行一步改 性，简化了合成步骤，获得了具有羧酸基团的弱阳离子交换毛细管整体柱，并考察了其对于蛋白的分 离能力。 1 实验部分 1 1 仪器与试剂 A g i l e n t1 1 0 0H P L CQ u a t P u m p ；毛细管电泳紫外检测器，北京彩陆科学仪器有限公司；0 3 2m mI D 弹性石英毛细管柱；K Y K Y2 8 0 0 扫描电镜；A u t o P o r eI V9 5 1 0M e r c u r yp o t o s i m e t e r 汞渗透测孔仪。甲基 丙烯酸缩水甘油酯( G M A ) ，双甲基丙烯酸乙酯( E D
4、 M A ) ，y 甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷( 7 - M A P S ) ；正丙醇，1 ，4 丁二醇，偶氮二异丁腈( A I B N ) ，胰蛋白酶，粗卵蛋白，溶菌酶，亚胺乙二酸 ( I D A ) ；实验用水为二次蒸馏水。 1 2 弱阳离子交换毛细管整体柱的制备 1 2 1 弹性石英毛细管的预处理先对石英毛细管的内壁作预处理，引入双官能团试剂T - M A P S ”1 ： 利用水泵的负压将O 1m o l f LN a O H 、水、丙酮依次引入通过毛细管；通入氮气，吹干毛细管； 将3 0 的7 一甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液充满经步骤处理后的毛细管内，密封，在6 0 水浴内
5、2 4h ；用丙酮清洗毛细管，氮气吹干，备用。 1 2 2 离子交换整体柱的制备分两步进行：将0 3 2 5m LG M A 、0 0 7 5m LE D M A 、4m gA I B N 、 0 3 6m L 正丙醇、0 1 8m L1 ，4 丁二醇、0 0 6m L 水混合，超声混匀，通氮气3m i n ，将溶液装入毛细 管中，将两端密封，放入6 0 “ 1 2 恒温水浴中连续加热2 4h ，通过热引发在柱管中原位聚合得到聚甲基丙 烯酸缩水甘油酯整体柱。去掉塞子，用乙醇和水冲掉未反应的单体。5gI D A 和2gN a C l 加入5 0m L 2m o l LN a 2 C O ，缓冲液
6、中，用N a O H 调节p H 至1l ，用泵将该溶液以1 0p L m i n 流速循环流过直接合成 好的甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱，7 0 反应1 2h 。反应完成后，用1 0 倍水冲洗，再用0 1m o l L N a O H 溶液以0 0 5m L m i n 冲洗整体柱。 1 3实验条件 样品：粗卵蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶；检测波长2 8 0n m ，柱长5c m ，内径0 3 2m m ；流动相： A 1 0m m o l LN a 2 H P 0 4 一H C l ( p H = 6 ) ，B A + 1m o L LC H 3 C O O N a ( p H = 6 ) ；流速
7、：0 1m L m i n ； 0 。2m i n ，0 B ；2 2 1m i n ，0 5 B ；2 1 3 1m i n ，5 B ；3 1 3 2m i n ，5 一2 0 B ；3 2 4 2m i n ，2 0 B ；柱压：1 6 1 07 P a ；进样量：1m L 。 2 结果与讨论 2 1 整体固定相的表征及反应条件优化 考察了致孔剂混合物的组成及交联剂的含量对整体固定相孔结构的影响，以孔隙率、微观形态的 一1 0 1 第2 5 卷分析测试学报增刊 测定，评价了整体固定相的结构特征。表1 列出了聚合混合物各试剂用量的配比。其中，A I B N 在聚合 混合物中的用量保持不变，
8、质量分数为0 3 。聚合温度保持在6 0 ，恒温2 4h 。综合考虑柱通透性、 刚性，在后面的实验中选择柱e 。 表l聚合混合物各试剂质量比 单体混合物 G M AE D M A 致孔剂混合物 水 1 1 1 1 l 1 正丙陴1 ，4 - 丁二醇 单体一致孔剂( 体积比)孔隙率 4 5 4 O 4 5 4 5 4 5 4 5 3 5 4 3 3 5 3 5 3 5 3 5 l ：l 1 ：l l ：l 2 ：3 2 ：3 2 ：3 0 3 6 O 3 3 O 5 0 0 5 2 2 2弱酸性阳离子交换毛细管整体柱对蛋白质的分离 在制备的5c m 长，0 3 2m m 内径的弱阳离子交换整体柱
9、上分离了3 种蛋白质，结果见图1 。可以看出，能够对蛋白质很好地分离。另外，由 于采用了毛细管柱，与常规柱相比，色谱分离流动相的消耗量大大降低。， 目 参考文献： 孓 1 陈令新，关亚风，马继平 J 化学进展，2 0 0 3 ，1 5 ( 2 ) ：1 0 7 1 1 6 2 H O L L A N DLA ，J O R G E N S O NJw J A n a lC h e m ，1 9 9 5 。6 7 ：3 2 7 5 3 2 8 3 3 S V E SF ，P E T E R SEC ，S Y K R AD ，e ta 1 J JC h r o m a t o g r ，A ，2 0
10、 0 0 ， 8 8 7 ：3 2 9 4 卫引茂，黄晓冬，陈强，等 J 分析化学，2 0 0 0 ，2 8 ( 1 0 ) ：1 1 9 4 一1 1 9 8 0 24 6 1 0 1 2 1 4 F n i l l i t 5 E R I C S O NC h ，L I OJL ，N A K A Z A T OK ，e ta 1 J JC h r o m a t o g r ，A ，1 9 9 7 ，7 6 7 ： 3 3 图l弱阳离子交换毛细管 整体柱对蛋白质的分离 P r e p a r a t i o no fW e a kC a t i o n E x c h a n g eC a
11、 p i l l a r yL i q u i dC h r o m a t o g r a p h y M o n o l i t h i cC o l u m na n dI t sA p p l i c a t i o ni nS e p a r a t i o no fP r o t e i n s M Aj i - p i n 9 1 ，Z H E N GR u i 2 ，D I N GM i n g y u 2 ( 1 I n s t i t u t eo fE n v i r o n m e n t M u n i c i p a lE n g i n e e r i n g ，
12、Q i n g d a oT e c h n o l o g i c a lU n i v e r s i t y ，Q i n g d a o2 6 6 0 3 3 ，C h i n a ； 2 D e p a r t m e n to fC h e m i s t r y ，T s i n g h u aU n i v e r s i t y ，B e i j i n g1 0 0 0 8 4 ，C h i n a ) A b s t r a c t ：W e a kc a t i o ne x c h a n g em o n o l i t h i cc a p i l l a r y
13、c o l u m n ( 5c mx0 3 2m mI D ) w e r ep r e p a r e db yi n s i t u p o l y m e r i z a t i o no fg l y c i d y lm e t h a c r y l a t ea n de t h y l e n ed i m e t h a c r y l a t e ，a n dt h e nm o d i f i e db yi m i n o d i a c e t i ca c i d P r o t e i n sw e r ，es e p a r a t e do nt h ew e a kc a t i o ne x c h a n g ec o l u m ns u c c e s s f u l l y K e yw o r d s ：C a p i l l a r yH P L C ；C a p i l l a r yi o nc h r o m a t o g r a p h y ；M o n o l i t h i cc o l u m n s ；W e a kc a t i o ne x c h a n g e - 1 0 2 - -
