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1、,一、复习 二、微生物的生长曲线 三、微生物的生长曲线的测定-方案汇报 四、食品微生物检测,1,1.微生物菌种的保藏,为什么要进行菌种保藏 菌种保藏的目的 菌种保藏的原理 菌种保藏的方法,2,斜面低温保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法,2、菌种的复壮,狭义的复壮消极的措施 指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。,广义的复壮积极的措施 指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产
2、性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。,菌种复壮的主要方法,1、纯种分离法,菌落纯（“菌种纯”）,细胞纯（“菌株纯”）,通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。,平板表面涂布法,平板划线分离法,琼脂培养基浇注法,用分离小室进行单细胞分离,用显微操作器进行单细胞分离,菌丝尖端切割进行单细胞分离,二、生长曲线的测定,任务一：认识生长曲线的概念 任务二：为生长曲线的绘制设计实验方案,7,任务一：什么是生长曲线,什么是微生物的生长曲线,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定
3、时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,9,10,将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。 不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。,11,12,哪些情况下需要测定微生物的生长 曲线？,1.工业发酵中往往要接入处于对数期(特别是中期)的菌体，以尽量缩短停滞期。 2.分子生物学实验中，选择对数期的菌体，制备感受态细胞，进行基因工程实验
4、,13,任务二：设计实验方案,1. 任选大肠杆菌或酵母菌 2.结合实验室实际情况，设计实验方案，要求包括： （1）实验原理 （2）材料与方法 （3）预期结果,15,接下来请大家汇报实验方案,本次的作业：请大家设计实验方案，要求包括： （1）实验原理 （2）材料与方法 （3）预期结果 A4纸打印上交,四、食品微生物检测,一、食品微生物的检验流程 二、食品微生物样品采集与制备 三、食品微生物检验 1.食品中菌落总数检测 2.食品中霉菌和酵母菌检测 四、制定实验方案,19,食品检验的目的,1.便于食品卫生质量监督管理； 2.鉴别食品中是否存在有毒有害物质 3.为新产品、新资源利用、新食品等进行卫生鉴
5、定,一.食品微生物检验的一般步骤,样品采集,样品处理,样品保存,选择参考菌群,检验前的准备,菌落总数,大肠菌群,致病菌,分离培养,分离培养,增菌,纯化,染色镜检,生化试验,血清学试验,动物试验,结果报告,二、食品微生物样品采集与制备,取样：代表性 微生物检验的取样过程中，避免操作引起污染。 一个无菌样品的采集，应该通过这样一种方式，即：在收集过程中，本身应避免污染，然后放入消毒容器中。,22,（一） 检验前的准备,准备好所需的各种仪器，如冰箱、水浴锅、培养箱等。 按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗、烘干、包扎、灭菌，冷却后送无菌室备用。 准备好所用的各种试剂，制备营养琼脂或其他培养基。 做好无菌
6、室或超净工作台的灭菌工作，提前灭菌3050min. 准备好采样必需的工具和器材，如剪刀、镊子、勺子等。 采样后样品运输、保存相关准备。,（二）样品的采集,采样的步骤,采样前调查现场观察确定采样方案采样 样品封存 开具采样证明,采样的原则,1、根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案 2、应采用随机原则，确保所采样品必须具有代表性。 3、采样操作必须遵循无菌原则，要防止污染，防止变质、损坏、丢失。严格遵守样品采集的操作规程。 4、样品在保存和运输过程中，应采取措施防止样品中原有微生物数量的变化，不得加入防腐剂、固定剂等。 5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加 。
7、,食品微生物检验的采样方案,微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。 要保证样品的代表性首先要有一套科学的抽样方案，其次使用正确的抽样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。 目前最为流行的抽样方案为ICMSF推荐的抽样方案和随机抽样方案。无论采取何种方法抽样，每批货物的抽样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，抽样数量应适当增加，最低不少于8件。,样品的种类,大样，就是一整批； 中样，是从样品中各部分取得的混合样品，一般每批抽样数量不少于5件，一般为200g
8、； 小样，也称检样，直接进行分析用的，一般为25g。,食品微生物检验的采样方案,ICMSF取样方案； 美国FDA的取样方案； 世界粮农组织（FAO）取样方案； 我国的食品取样方案。 ICMSF(The Intermational Committee on Microbiological Specification for Food) 国际食品微生物标准委员会,食品微生物检验采样方法,采样原则： 能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样.,1、液体样品采样方法,充分混匀后，无菌操作打开包装，用100mL无菌注射器抽取,注入无菌盛样容器.,2、半固体样品采样方法,无
9、菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。,3、固体样品采样方法,大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性； 小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。 若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。,4、冷冻食品采样方法,大包装小块冷冻食品按小块个体采取； 大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。 若为检验食品污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质情况，应从深部取样。,5、生产工序监测采样,车间用水：从车间各龙头采样； 车间台面、用具、及加工售货员手的卫生监测：用5c
10、m2孔无菌采样板和5支无菌棉签擦拭25cm2面积，擦拭后立即用无菌剪刀将棉签头剪入无菌容器中。,车间空气采样：将5个直径90mm的普通琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖盖送检。,平皿,（七）采样标签的填写,标签内容主要： 编号、样品名称、生产单位、生产日期、产品批号、产品数量、存放条件、采样时间、采样人姓名，现场情况。,采样单 样品编号：产品名称（商品名）_规格型号_注册商标_生产厂家_通讯地址_邮政编码 受检地点_通讯地址_邮政编码 采样地点_采样日期_采样基数_生产日期_批 号_产品依据标准_有效成分及含量_检验目地_检测项目_ 采样人仔细阅读以下句子，然后签字
11、我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填写的合法性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和公正性。 代表单位（章） 代表单位（章） 签字 签字 日期 年 月 日 日期 年 月 日 备 注,四.样品的送检要求,1、要快速运送：不要超过3小时； 2、若路途遥远，可在15低温下运送； 3、要注意防污染、防散漏、防变质； 4、要填写检验申请单。,五.样品的处理方法,（一）液体样品 （二）固体样品 （三）冷冻样品,（一）液体样品的处理,瓶装液体样品的处理 盒装或软塑料包装样品的处理,1.瓶装液体样品的处理,用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布
12、盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开； 含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。,2.盒装或软塑料包装样品的处理,将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL ，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。,（二）固体样品的处理,捣碎均质法 剪碎振摇法 研磨法 整粒振摇法 胃蠕动均质法,1.捣碎均质法,将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，800010000r/min均质12min即可。,视频：无菌均质器,2.剪
13、碎振摇法,将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。,3.研磨法,将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌乳钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。,4.整粒振摇法,直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。,（三）冷冻样品,冷冻样品，先将中样在04 下解冻，时间不能超过18h，或在45 下解冻，时间不能超过15min。再取检样2
14、5g做稀释处理。,请大家参考p229 附录五 中国食品微生物限量规定列出的食品，选择一种制定样品的采集与制备方案，包括： 1）选择何种食品 2）用品准备 3）样品采集具体操作步骤 4）样品处理具体操作步骤,作业要求：,提交一篇小论文：XX菌落总数的检测报告 前言：介绍实验背景 一、材料与方法 二、检测结果 三、结果分析,52,参考论文,三、食品微生物检验,54,1.食品中菌落总数检测,菌落总数：食品检样经过一定处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得1g（1mL）检样中形成的微生物菌落总数。 菌落计数以菌落形成单位（cfu）表示 国标规定：在需氧情况下，37培养48h，
15、能在普通琼脂平板上生长的细菌菌落总数 不能生长的细菌：厌氧菌，微需氧菌，有特殊营养要求的，非嗜中温的细菌 菌落总数主要用作判定食品被污染程度的标志,55,食品中菌落检测方法P116,56,2.食品中大肠菌群检测,大肠菌群：一群在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽胞杆菌。多存在于温血动物粪便。 大肠菌群数的高低表明了粪便污染程度,57,食品中大肠菌群检测P119,58,3.食品中霉菌和酵母菌检测,食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含霉菌和酵母菌菌落数。,59,食品中霉菌和酵母菌检测P122,60,四、制定实验方案,请大家参考课本，并查找国标法，制定XX食品中霉菌数的检测方案，包括： 1.实验所需仪器与材料 2.
