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1、有丝分裂,细胞周期（cell cycle） G1期 S期 间期（interphase） 细胞周期 G2期 前期 (prophase) M 期 中期 (metaphase) 后期 (anaphase) 末期 (telophase),为什么还要学习DNA的复制? 1,详细探究DNA复制的分子机制对认识 生命现象有重要的意义 人类的寿命,疾病. 2, 基于复制原理发展的生物技术在工农 业上均发挥着重要的作用.,内容提要： DNA的半保留复制 与DNA复制有关的物质 DNA的复制过程（大肠杆菌为例） DNA复制的其它方式 真核生物中DNA的复制特点 基于复制原理的PCR技术,DNA复制,第一部分 DN
2、A半保留复制,DNA双螺旋结构的发现奠定了分子生物学的基础,DNA的复制 由Watson-Crick模型预言的DNA复制是半保留式的。半保留复制（semiconservative Replication）：每个子代DNA分子含有一条旧链和一条新链。,半保留复制 Semiconservative Replication 每个子代DNA分子含有一条旧链和一条新链。,DNA的复制, DNA是遗传物质，作为遗传物质的首要条件是必须能自我复制。 Watson和Crick阐明的DNA模型预示了DNA具有复制的能力，通过氢键配对的方式复制新链。 曾设想有三种复制方式：（1）半保留式；（2）保留式； （3）分
3、散式。,(1),+,(2),+,(3),+,曾设想有三种复制方式：保留式 ，半保留式，分散式,1、定义：由亲代DNA生成子代DNA时，每个新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式称半保留复制。,DNA的半保留复制,2、实验证据（1958 Messelson 和Stahl）：,Matthew Messelson Franklin Stahl 1930.05.24 1929.10.08,Photograph taken by F. L. Holmes of Matt Meselson and Frank Stahl in 1996, standing at
4、the site where they met at Woods Hole 42 years earlier.,Meselson-stahl实验 1958年，Meselson等证明DNA的复制是半保留式的。 1氯化铯超离心技术的原理 DNA在CsCl溶液中经超速离心后，最终停留在某一位置上，这时离心力的大小正好等于DNA分子在CsCl梯度中的浮力。DNA的浮力是由其密度决定的。根据离心后DNA在梯度中达到的平衡位置的不同可以将不同密度的DNA分子分开，例如：15NDNA和14NDNA。,2将E.coli培养在含有“重”同位素15N的培养基中，经多个世代后，细胞中DNA就标记上“重”同位素。然后
5、将细胞转到14N培养基中，经过一个或两个细胞分裂周期后，分离DNA，再进行CsCl离心。 3. 结果：经一个世代后，DNA形成了一条中间密度带。其位于“重”带和“轻”带之间。经两个世代培养后，DNA形成两条带，一条中间带，一条轻带。更直接的证据是将在14N中生长一代的细胞DNA（15N14N）变性后离心，可以得到一条重带和一条轻带。说明第一代杂种分子是半保留复制的产物。双链中一条是亲代15N，另一条是新合成14N，DNA为15N14N。,Meselson-stahl实验 The Meselson-Stahl experiment,Meselson-stahl实验结果的解释,将H3-胸苷标记大肠
6、杆菌DNA, 然后用溶菌酶把细胞臂消化掉,使完整的DNA释放出来,铺在透析膜上,通过放射自显影的方法观察DNA复制的状态,黑点的浓度和轨迹代表了DNA分子的密度和形状.,Cairns 复制-大肠杆菌复制的直接证据,DNA复制的机制,其核心在于：DNA双螺旋中的两条链都携带相同的信息，其碱基对是互补的； 因此，在复制过程中两条亲代链分离，分别作为模板引导酶催化的新生互补子链的合成，并遵循标准的碱基配对原则，两条新生双链在细胞分裂时分别进入两个子细胞；,DNA复制的复杂性 1, DNA分子复制中的几何学问题 2, 双螺旋链的解开? 3, 一种酶仅能催化有限的化学反应 4, 复制过程中的错误的纠正?
7、 5, 不同生物DNA复制的方式及过程?,第二部分 与DNA复制有关的物质,(一) 引子: DNA分子复制中的几何学问题,基因组超螺旋,电镜结构显示，就整体而言，大肠杆菌的基因组是由大量超螺旋的结构域构成的,原核生物基因组结构,6.8:1,40:1,1000:1,8000:1,DNA double helix,Nucleosome (10 nm fiber),30 nm Fiber,Loops I,Loops II,chromosome,DNA分子复制过程的几何学,线状DNA形成的超螺旋,环状DNA形成的超螺旋,DNA扭曲与双螺 旋相同（拧紧）,DNA扭曲与双螺旋相反（松开）,负超螺旋,松弛D
8、NA,正超螺旋,大多数天然DNA 都具有负超螺旋,在复制的开始阶段可以缓解由于DNA复制而造成的超缠现象,当原有的负超螺旋用完时(5%),就需要引入新的负超螺旋,以缓解复制的阻力.,拓扑异构体及拓扑异构酶,拓扑异构体：给定连接数的DNA分子。 拓扑异构酶： I型和II型、DNA促旋酶（ATP）。,Action of a type I topoisomerase.,Action of a type II topoisomerase.,每一次反应可以引入两个负超螺旋,（二）与DNA复制有关的物质,1、原料：四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、 dCTP、dTTP) 2、模板：以DNA的两条链为
9、模板链，合成子代DNA 3、引物：DNA的合成需要一段RNA链作为引物 4、引物合成酶（引发酶）：此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。,5、DNA聚合酶:以DNA为模板的DNA合成酶 以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物 反应需要有模板的指导 反应需要有3-OH存在 DNA链的合成方向为5 3,DNA聚合酶的分类,原核生物的DNA聚合酶：,DNA-pol （1958，Arthur Kornberg） DNA-pol (1971, Thomas Kornberg） DNA-pol (1972, Thomas Kornberg）,He wa
10、s the first to identify the enzyme catalyzing the synthesis of DNA, polymerase I. In recognition of their work elucidating the basic mechanisms of DNA replication, they were awarded the Nobel Prize in 1959.,Arthur Kornberg (1918 - 2007),His father is Arthur Kornberg (1918-2007), winner of the 1959 N
11、obel Prize in Medicine, and his older brother is Roger D. Kornberg (born 1947), winner of the 2006 Nobel Prize in Chemistry.,科恩伯格的长子罗杰科恩伯格子承父业，也在基因研究领域取得卓越成绩。2006年12月，罗杰科恩伯格凭借在“真核转录的分子基础”研究领域的贡献，独享诺贝尔化学奖。,Thomas Kornberg born 1948, 对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol ,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段 / K
12、lenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,常用工具酶,DNA聚合酶的功能,1. 53聚合功能 2. 35外切活性 3. 53外切活性 (1)切口平移（nick translation）； (2)链的置换； (3)模板转换（template-switching） 4. 内切酶活性,核酸必须有5磷酸末端,且已经正确配对,以一个接一个的方式去除,可以是DNA, 也可以是RNA.,在复制延长过程中 真正催化新链核苷酸聚合的酶,DNA-pol ,主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。,修复紫外光引起的DNA损伤,DNA 复制的主要 聚
13、合酶，还具有3-5外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性,原核生物中的DNA聚合酶(大肠杆菌）,6、DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。,但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来 DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用,7、DNA 拓扑异构酶(DNA Topisomerase)： 拓扑异构酶：使DNA一条链发生断裂和再连接，作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区，同转录有关。 例：大肠杆菌中的蛋白 拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺
14、旋引入DNA分子。同复制有关。 例：大肠杆菌中的DNA旋转酶,8、DNA 解螺旋酶/解链酶（DNA helicase) 通过水解ATP获得能量来解开双链DNA。 E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，还有解螺旋酶I、II、III。,rep蛋白沿35移动，而解螺旋酶I、II、III沿53移动。,9、单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding protein)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。,第三部分:DNA的复制过程（大肠杆菌为例）,双链的解开 RNA引物的合成 DNA链的延伸 切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的 DNA片段,DNA的复制
15、有特定的起始位点，常包含富含A、T的区段叫做复制原点。 复制原点常用ori(或o）表示。,基本概念：,复制起始区的结构特点：,（1）富含AT的3个13bp的串联重复序列，这可能和双链易于解开起始复制有关； （2）具有4个9bp的反向重复顺序，作为蛋白结合位点；,1、复制起始点（E.coli-oriC:245bp）,双链解开、复制起始,DnaA蛋白辨认起始点, 形成起始复合物, HU蛋白促进起始;,b) DnaB蛋白解螺旋, DnaC蛋白协助DnaB;,1,双链的解开: 在多种蛋白质参与下，DNA解开成单链（包括RNA聚合酶，协助DNA双链的解开）,c) SSB维持单链稳定;,大肠杆菌DNA的复
16、制过程,大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合,在HU蛋白和ATP的共同作用下,Dna复制起始复合物使3个13bp直接重复序列变性,形成开链,解链酶六体分别与单链DNA相结合(需DnaC帮助),进一步解开DNA双链,2、RNA引物的合成,DnaB蛋白活化引物合成酶DnaG ，引发RNA引物的合成。引物长度约为几个至10个核苷酸。,引物合成,Dna A,Dna B、 Dna C,DNA拓扑异构酶,SSB,3,5,3,5,DNA的半不连续复制DNA:复制时其中一条子链的合成是连续的，而另一条子链的合成是不连续的，故称半不连续复制。,在DNA复制时，合成方向与复制叉移动的方向一致并连续合成的链为前导链；合成方向与复制叉
