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1、硕士学 单位代码：1042 2 学号：20 0 71284 8 茹办呈 ! 叉 Sha nd o n gU n i v e r s i t yM aster I sThesiS 论文题目：开博通和氯沙坦对血管紧张素I I 诱导 W i s t a 大鼠血管平滑肌细胞b c l 2 和F a s 基因表达的抑 制作用 T h ei n h i b i te f f e c t so fC a p t o p r i la n dL o s a r t a nt ot h e e x p r e s s i o no f b c l 一2a n dF a si nt h ev e s s e ls
2、 m o o t hm u s c l ec e l l s o fW i s t ar a t s 2 0 1 0 年0 4 月1 5 日 作专导 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：趣堡日期：丝! ：兰：歹 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件
3、和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：刁色五丝母师签名：莹! 垒日期：丝1 2 ：皇 前言。2 1月看 材料与仪器。14 方法17 结果23 讨论25 综述29 附录一表格35 附录二图片1 38 附录三图片2 4l 参考文献1 44 参考文献2 48 52 53 1 5 l 1 12 M a t e r i a l sa n di n s t r u m e n t s ，14 M e t h o d s 17
4、R e s u l t s 23 D i s c u s s i o n 25 R e v i e w s 。29 A p p e n d i xO n eT a b l e s ：；5 A p p e n d i x T w oF i g u r e s l 3 8 A p p e n d i xT w oF i g u r e s 2 4 1 R e f e r e n c e s l 44 R e f e r e n c e s 2 。4 8 A c k n o w l e d g m e n t 5 2 53 管平滑肌细 研究生李劲迈 导师朱清 中文摘要 背景和目的： 自从十九世纪末肾
5、素发现以来，基础医学对肾素血管紧张素系统( r e n i n a n g i o t e n s i ns y s t e m ，R A S ) 的认识和研究已经经历了一个多世纪。R A S 作为心血 管系统的重要调节因素，对动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i sd i s e a s e ，A S ) 疾病的 发生和发展发挥了关键的作用。众所周知，A S 疾病的主要危险因素有高血压、 糖尿病、以胰岛素抵抗为特征的代谢综合征等，而R A S 系统的激活在上述危险因 素的发生、发展中扮演着重要的作用。在上述疾病中由血管平滑肌细胞( v a s c u l a
6、 r s m o o t hm u s c l ec e l l s ，V S M C ) 增殖与凋亡参与的血管重构促进了病程的进展。 血管紧张素I I ( a n g i o t e n s i nI I ，A n gI I ) 是R A S 系统的一个主要活性成分， A n gI I 通过其1 型( a n g i o t e n s i n1 ，A T l ) 受体发挥其对心血管系统的作用。局部 血管的R A S 能直接影响血管的功能状态以及内皮细胞功能，造成V S M C 的增殖和 肥大，从而导致了高血压、A S 疾病的血管重构。A n g I I 能促进原癌基因和多种生 长因子和其它
7、激素如内皮素( e n d o t h e l i n ，E T ) 的m R N A 表达，使V S M C 增殖、 肥大及细胞间基质增加。反过来，A n gI I 也可以通过上调一氧化氮合酶( n i t r i c o x i d es y n t h a s e ，N O S ) 的1 1 1 6 L N A 表达，一氧化氮能使血管平滑肌细胞中B c l 一2 表达降低，而使B a x 、P 5 3 和F a s 表达升高，这些结果进一步证明T A n g I I 能介导 V S M C 的凋亡，抑制v S M C 生长。但在高血压、糖尿病及代谢综合征患者体内， 促生长因子和生长抑制因
8、子两者间的平衡关系被打破，此时V S M C 表现为肥大和 增殖，并且对体内的血管活性物质的反应性升高，导致血管壁增厚。细胞凋亡过 程是多种调节基因参加的复杂的分子水平调节机制，目前为止研究较多的和平滑 肌细胞凋亡相关的基因有B c l 2 、p 5 3 、c y c 、f a s 等，上述基因各自通过不同 的信号传导通路影响细胞的凋亡过程。 山东大学硕士学位论文 本实验拟研究这两种R A S 阻滞剂在拮抗A n g I I 诱导的W i s t a 大鼠V S M C 凋亡 相关基因B c l 2 及F a s 表达方面的作用，从而探讨这两种药物对A n gI I 诱导的 V S M C 平
9、滑肌细胞增殖的作用。 R A S 在A S 相关疾病患者中均有不同程度的激活，该系统的阻断剂是目前 A S 相关疾病临床治疗的基础药物，R A S 的阻滞剂肾素血管紧张素转换酶抑制剂 ( a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r ， 拮抗A n gI I 的生理作用而发挥其治疗作用的。 A C E I ) 及A T l 受体拮抗剂主要是以 目前R A S 系统阻断剂药物的临床 研究主要局限于其对血压的控制和对心脏重构的影响方面，而关于R A S 系统与 血管平滑肌细胞增生肥大导致的血管重构及其干预
10、因的研究尚且不多，本课题研 究了A n gI I 对W i s t a 大鼠血管平滑肌细胞( v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l ，V S M C ) 凋亡相关基因B c l 2 和F a s 表达的影响以及肾素血管紧张素转化酶抑制剂开博通 和血管紧张素受体1 拮抗剂氯沙坦对A n gI I 这一作用的干预作用，以期探索R A S 阻滞剂对A S 相关疾病的临床防治中更多的理论依据。 方法： 1 培养W i s t a 大鼠胸主动脉V S M C 。 1 ) 选用雄性W i s t a r 大鼠，断颈处死，取其胸主动脉原代培养；V S M
11、C 传代 培养采用常规贴壁细胞培养方法进行。传代至5 1 0 代，用于实验分组。 2 ) 取培养的V S M C 制作半薄及超薄切片，采用免疫细胞化学染色后，置于 光学显微镜及电子显微镜下观察，并鉴定是否为目的细胞。 2 将培养的V S M C 随机进入如下分组 1 ) 对照组V S M C 用含0 5 F C S 的培养液培养，不加特殊试剂干预。 2 ) 按照不同A n g I IN ) 变( 1 0 一、1 0 、1 0 、1 0 。5 和1 0 4m o l L ) 对V S M C 的 影响及开博通( 1 0 m o l L ) 、氯沙坦( 1 0 5m o 儿) 和上述两药合用( 5
12、 1 0 6m o l L ) 的 干预作用分组。 3 ) 按照不同A n g I I 作用时间( 1 2 、2 4 、4 8 和7 2 小时) 对V S M C 的影响及 开博：N ( I O m o l L ) 、氯沙坦( 1 0 5m o l L ) N I _ J 2 述N 药合N ( s x 1 0 石m o l L ) 的= P 预作 用分组。 4 ) 应用流式细胞仪对上述各组V S M C 凋亡相关基因B c l 2 及F a s 的表达阳 性率进行检测。 结果： 2 山东大学硕士学位论文 1 A n g l I 、开博通和氯沙坦对B c l 2 表达的影响 1 ) 给予V S
13、M C 以不同剂量A n g l I 作用后，细胞内B c l 2 表达呈逐渐升高趋 势，表现出在一定范围内的剂量依赖性；除1 0 。8m o l L 组外，A n g l I 其余各浓度 组B c l 2 表达量较对照组显著增加( P O 0 1 ) ；但1 0 4m o l L 时，B c l 2 表达量较 1 0 5 m o l L 时有所下降；加入开博通、氯沙坦和开博通+ 氯沙坦干预后，B c l - 2 表 达量均明显下降；与A n g l I 组比较，当A n g l l 分别为1 0 、1 0 。6 、1 0 5 和1 0 4m 0 1 L 时，开博通组B c l 2 表达量分别下降6
