《应用酵母双杂交系统筛选与禽流感核蛋白相互作用的蛋白质》由会员分享，可在线阅读，更多相关《应用酵母双杂交系统筛选与禽流感核蛋白相互作用的蛋白质（70页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、专业：预防兽医学 获得学位名称：农学硕士 研究方向：动物传染病 获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学动物医学院 二。一O 年六月 一-一 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 径 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导| 疖指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此迸行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示
2、了谢意。 研究生签名：中囊恩 时间： 刃伊年6 月f 口墨 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阕览服务，可以采用影印缩印或扫描等复刳手段保存、汇编掌位 论文本人同意华中农业大学可以用不淘方式在不同媒体上发表，传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 1 4 3 涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密妁论 文) 在解密后适用于本授权书 学雠文作糍：穸媲导撇：露斛 签名日期：加I o 年6
3、 月I o 日 签名日期：加f 。年0 月I o 日 注：请将本表直接装订在学假论文的扉页和目录之闯 酵母双杂交筛选与禽流感核蛋白N P 相互作用的蛋白 目录 摘要1 A B S T R A C T 。3 缩略词表5 1 文献综述7 1 1 禽流感病毒7 1 1 1 流感病毒的发生和危害7 1 1 2 流感病毒形态和基因组结构8 1 1 3 流感病毒流行病学9 1 1 4 禽流感基冈编码蛋白的功能9 1 1 5 禽流感病毒的预防和治疗1 0 1 2 禽流感病毒核蛋白研究进展11 1 2 1 N P 基因保守性的研究l l 1 2 2 N P 基因编码的蚩白一1 1 1 3 酵母双杂交的研究进展
4、1 3 1 3 1 酵母双杂交技术的基本原理1 4 1 3 2 酵母叔杂交技术的应用1 4 1 3 3 酵母双杂交技术的优缺点1 6 2 研究目的和意义18 3 实验材料和方法1 9 3 1 菌种和质粒1 9 3 2 主要试剂及试剂盒2 1 3 3 主要仪器2 2 3 4 培养基及其他试剂的配制2 2 3 5 分子克隆实验方法2 4 3 5 1 P C R 扩增目的片断N P 2 4 3 5 2 重组质粒p G B K T 7 N P 的构建2 6 3 6 酵母实验方法2 9 3 6 1 酵母菌的复苏与保存2 9 3 6 2 酵母感受态的制备及转化2 9 3 6 3 酵母菌株A H l 0 9
5、 ，Y 1 8 7 的表型验证2 9 3 6 4 酵母菌株载体表达及白激活检测3 0 3 6 5 文库滴度的测定一3l 3 6 6 入脑e D N A 文库的筛选3l 3 6 7 接合效率的计算3 2 3 6 8 酵母质粒的营救3 2 3 3 3 4 3 4 3 5 3 6 相互作用的宿主蛋白3 7 i ，j I 华中农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 3 8 1 酵母菌株A H l 0 9 ，Y 1 8 7 的表型验证3 7 3 8 2 诱饵质粒酵母菌株自激活及毒性检测3 7 3 8 3 酵母的结合及效率3 8 3 8 4 共转化结果3 8 3 8 5 阳性克隆的自激活3 9 3
6、8 6 序列比对和分析3 9 3 8 7A D 质粒的酶切鉴定4 1 3 8 8 回复杂交4 2 4 讨论与分析4 3 4 1 诱饵质粒的构建4 3 4 2 酵母菌株的筛选4 3 4 2 1 酵母菌株A H l 0 9 的培养4 3 4 2 2 酵母菌株的表型筛选4 4 4 3 酵母菌株对诱饵质粒的表达4 4 4 4 酵母双杂交筛选人脑e D N A 文库4 5 4 5 与禽流感核蛋白互作的蛋白4 6 5d 、结4 9 参考文献5 0 j l l 谢5 8 附匀之5 9 酵母双杂交筛选与禽流感核蛋白N P 相互作用的蛋白 摘要 禽流感病毒( A v i a nI n f l u e n z a
7、V i r u s ，A I V ) 是由A 型流感病毒引起的一种禽类的烈 性传染病。禽流感核蛋I 刍( n u c l e o p r o t e i n ，N P ) 是流感病毒的结构蛋白，不仅在流感 病毒的复制及感染方面起重要作用，还是决定病毒的宿主特异性的一个重要蛋白。 N P 对病毒在宿主细胞的穿梭过程也起到了决定性作用，它可以同细胞多肽如肌动 蛋白相互作用，对与禽流感病毒核衣壳蛋白复合体以及相关蛋白的出核运输有较为 重要的功能。为了了解禽流感核蛋白N P 对病毒的转录，复制和包装的作用，以及 它能和细胞内哪些蛋白相互作用，本实验应用了酵母双杂交技术筛选对禽流感核蛋 白N P 相互作
8、用的蛋白。 本研究以禽流感核蛋白N P 为诱饵，构建了诱饵质粒p G B K T 7 - N P ，并对这个质粒 进行了对酵母菌的毒性的检测，以及进行了自身能否激活报告基因的检测。结果表 明该诱饵质粒并没有影响酵母的正常生长，同时也没有发现自激活现象，能够应用 于筛选。 将此诱饵质粒转入酵母菌A H l 0 9 和携带文库的Y 1 8 7 酵母菌进行交配，利用显微 镜观测到这两种不同交配型的酵母配子体通过交配形成了二倍体。两者的结合菌使 得两种不同的质粒转入了同一酵母菌株中，并且发生了一定的相互作用，报告基因 被激活，表达下游基因，从而筛选到诱饵蛋白与人脑c D N A 文库的靶蛋白。 营救筛
9、选得到酵母质粒，并将这些质粒用同样的酵母转化的方法各自与 p G B K T 7 质粒共转入酵母感受态A H l 0 9 中，在用缺少腺嘌呤，组氨酸的S D 培养基 ( S D T r p L e u ) 和用缺少腺嘌呤，组氨酸，亮氨酸和色氨酸的S D 培养基 ( S D - T r p - L e u - H i s - A d e ) 平板上培养。在S D T r p L e u 能长出1 2 m m 的克隆，而 S D T r p - L e u - H i s A d e 平板上却没有，表明筛选到的单一文库质粒不能自发激活报 告基因。 通过N C B I 中B L A S T 分析，得
10、到了明确的蛋白序列，并从中挑选了与N P 相互作 的1 2 种融合蛋白质。这1 2 种蛋白分别为鸟苷酸调节蛋白( G N A S l ) ，F E R M 和P D Z 复合蛋白，转录调节因子L M 0 4 ，果糖二磷酸醛缩酶C ，蛋白精氨酸N 一甲基转移酶 1 ( p r o t e i na r g i n i n em e t h y l t r a n s f e r a s e1 ) ，网格蛋白( c l a t h r i n ) ，A T P 酶，肽基脯氨酰顺反 异构酶P i n l ( p r o t e i ni n t e r a c t i o nw i t hN I M A l ) ，锌指蛋t 兰1 6 6 8 ( z i n cf i n g e rp r o t e i n6 6 8 ) ， H I F 缺氧诱发因子一1 ，微管相关蛋I 兰t M A P l A ( m i c
