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1、分类号：又 弓广、2 -密级： I $ 2837S 应激性反应原作用于M icro R N A 与C D 44 之间 表达平衡进而影响胃癌干细胞的 表型形成的初步研究 S t r e s sr e l a t e dh o r m o n er e s u l t si nt h e p h e n o t y p eo fg a s t r i cc a n c e rs t e m c e l l b yb r e a k i n gt h eh o m o s t a s i s b e t w e e nC D 4 4a n dm i R N A3 7 3 作者姓名：卫勃 学科专业：外
2、科学( 普外) 导师：陈凛 答辩委员会主席：祝学光积馥l 论文答辩日期：2 0 10 年5 月28 日 院校地址：北京市复兴路2 8 号 邮政编码：10 0 8 5 3 军医进修学院 研究生学位论文原创性声明 秉承我院“政治合格、忠诚敬业、技术精湛、医德高尚“ 的学风，本人声明： 所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体 已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书 而使用过的材料，对本文的研究作出贡献的个人或集体，均已在文中做了明确的 说明并表示谢意。 申请学位论文
3、与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：啪or日期：肋o 奎Io 艚刻醛各膨席嗍幻口蚶口 军医进修学院 研究生学位论文版权使用授权书 本人保证毕业离院后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医进修 学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文原件、复 印件和电子版本，可以采用影印、缩印、扫描或其它手段保存论文以供被查阅和 借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) 。 论文作者签名：卫寿力 日期：加O 户lo 指导教师签名： 扔日期： 纭 西，、f 沪 ：- ： 目录 缩略词表 中文摘要 英文摘要 第一部分酶消化联合化疗药物筛选法分离胃
4、癌干细胞 一、前言 二、材料和方法 1 主要试剂及来源 2 主要仪器 3 标本采集和处理 4 主要试剂配置 5 肿瘤细胞的分离与培养 6 化疗药物筛选培养及M T T 检测 7 流式细胞仪检测分析 8 W e st e r nb l o t 检测分析 9 统计学处理 三、结果 1 胃癌原发灶及转移灶内肿瘤干细胞的分离、培养及表型检测 2 化疗药物的选择 3 胃癌干细胞的筛选及表型检测 四、讨论 五、参考文献 小结 第二部分 应激性反应原作用于M i c r o R N A 与C D 4 4 之间的表达平衡 影响胃癌干细胞的表型形成 一、前言 二、材料和方法 1 主要试剂及来源 2 7 2 7
5、2 8 2 8 3 5 7 7 8 8 加 加 加 n 心 n “ “ 埔 勉 ” 2 主要仪器 3 标本采集和处理 4 主要试剂配置 5 细胞培养及转染 6 半定量R T - P C R 及实时定量P C R 7 M T T 检测分析 8 W e st e r nb l o t 检测分析 9 双荧光素酶报告基因活性检测分析 1 0 统计学处理 三、结果 1 m i R - 3 7 3 参与调节C D 4 4 在胃癌干细胞中的表达 2 应激性神经内分泌激素影响C D 4 4 在胃癌干细胞中的表达 3 应激性神经内分泌激素影响m i R - 3 73 在胃癌干细胞中的表达 4 应激性神经内分泌激
6、素通过活化S T A T 3 和A P - 1 影响胃癌干细胞的表型改变 5 应激性神经内分泌激素能够对 胃癌干细胞形成及生物行为具有促进作用 6 B 一肾上腺素受体在胃癌原发灶和转移灶内的表达差异 四、讨论 1 m i R l q A 的生物合成及基因表达调控机制 2 m i R N A 与肿瘤 3 m i R l q A 可能发挥类似癌基因或抑癌基因的作用 五、参考文献 小结 文献综述 附录( 基金赞助项目) 致谢 研究生期间撰写的文章 2 3 1 3 1 3 1 3 1 3 1 3 3 3 4 3 4 3 4 3 5 3 5 3 7 4 0 4 0 4 3 4 5 4 5 4 5 4 7
7、 4 9 5 4 6 1 6 3 8 5 8 7 8 9 U 越 军医进修学院博士学位论文 英文缩略词表 印m S D S T B S r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s o d i u md o d e c y l b e n z e n es u l f o n a t e t r i s b u f f e r e ds a l i n e T E M E D t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 嘶S T R A - P t r i s ( h y d r o x y m e
8、t h y l ) a m i n o m e t h a n e t e l o m e r er e p e a ta m p l i f i c a t i o np r o t o c o l 每分钟转数，转分 十二烷基磺酸钠 “ I r i s 缓冲盐溶液 四甲基乙二胺 三羟甲基氨基甲烷 端粒重复序列扩增程序 2 1 二 军医进修学院博士学位论文 应激性反应原作用于M ic r o R N A 与0 0 4 4 之间表达平衡 进而影响胃癌干细胞的表型形成的初步研究 中文摘要 肿瘤干细胞假说认为肿瘤中存在一小部分亚群细胞，其生长特性类似与正 常干细胞，具有自我更新，维持肿瘤生长和保持肿
9、瘤异质性的能力。虽然该理 论远未成熟，而且还存有诸多科学问题亟待解决，但经过学者们不懈努力，越 来越多的证据和实验结果均证实了肿瘤干细胞的存在。2 0 0 9 年，T a k ai s h i 等从 胃癌细胞系中分离得到了C D 4 4 表达阳性的细胞亚群，这些C D 4 4 + 细胞具有肿瘤 干细胞自我更新和肿瘤异质性的能力，还能够对化、放疗诱导的细胞程序性凋 亡产生抵抗作用。 目的：选择C D 4 4 作为分离标记，研究其在胃癌原发灶及转移灶组织内的表 达，通过酶消化联合化疗药物筛选法分离胃癌干细胞，并对原代分离培养的胃 癌干细胞的表型进行检测。以M i c r o R N A 和C D
10、4 4 之间表达平衡为突破口，研究 应激性反应原如何作用与这两者之间平衡影响干细胞的表型形成，为进一步从 新的角度揭示胃癌发生发展的可能分子机制，并针对肿瘤干细胞为靶点，为开 辟早期诊断、治疗胃癌的新途径奠定方法和理论基础。 方法：所有细胞培养均使用1 0 胎牛血清，加入配好的抗生素液体中( 青 链霉素1 0 0 U m L 、1 0 0 9 9 m L ) 。细胞表型检测使用流式细胞仪( B DF A C S C a li b u r ) 分选，未加荧光标记一抗的肿瘤细胞作为空白对照。W e s t e r nb l o t 检测C D 4 4 、 L i n 2 8 在胃癌原发灶和转移灶的
11、表达。半定量R T - P C R 及实时定量P C R 检测 m i R - 3 7 3 的表达，双萤光素酶检测分析S T A T 3 和A P - 1 表达水平，实时定量P C R 检测异丙肾上腺素处理后胃癌细胞系表面标记R e x - 1 和N a n o g 表迭，W e s t e r n b l o t 结果表明D 一肾上腺素受体在胃癌原发灶及转移灶表达。 结果：虽然胃癌原发灶及转移灶内均存在着C D 4 4 + 亚群细胞，但是相比原 发灶，转移灶内C D 4 4 + 亚群细胞的比例显著上调( 约3 0 倍) 。W e st e r nb l o t 检 测从蛋白水平上证实了C D
12、 4 4 、L i n 2 8 在胃癌原发灶和转移灶组织内存在着表达 差异。化疗药物筛选培养结果显示，C D 4 4 + 亚群细胞能够对奥沙利铂产生抵抗， 并且能够逃避奥沙利铂诱导产生的细胞程序性死亡。筛选培养后C D 4 4 + 细胞不但 具有强大的分离增殖能力，而且能够在体外培养形成球体克隆。 军医进修学院博十学位论文 m i R 一3 7 3 在胃癌原发灶及转移灶组织存在表达差异。m i R - 3 7 3 在原发灶内表 的量远远高于其在转移灶内的表达量。m i R 一3 7 3 可能通过正向调控 c a d h e ri n 影响E M T ，从而影响肿瘤细胞的侵袭能力。m i R -
13、 3 7 3 能够在体内和 体外抑制C D 4 4 的表达，影响胃癌干细胞的表型转化。m i R - 3 7 3 的启动子区域含 有S T A T 3 和A P - 1 结合位点，其上游信号通路活化后，通过激活S T A T 3 信号通路 和J N K S A P K 信号通路，抑制m i R - 3 7 3 的功能，间接地促进C D 4 4 的表达，使细 胞表型向胃癌干细胞的方向发生偏移。应激性反应原与其受体结合后，激活D 肾上腺素受体- c A M P - P K A 信号通路，从而上调S T A T 3 和c - J u n 的表达水平，影 响m i R 一3 7 3 的剪切及成熟，间接
14、地抑制C D 4 4 的表达及胃癌干细胞的表型形成。 结论：转移灶内C D 4 4 + 亚群细胞的所占的比例明显高于原发灶，C D 4 4 在胃 癌原发灶及转移灶组织内的表达差异可能与胃癌的侵袭、复发和转移有关， m i R - 3 7 3 与肿瘤的侵润和转移有着一定的联系，当慢性应激导致的神经内分泌 系统改变时，通过影响m i R 3 7 3 和C D 4 4 之间的表达平衡，肿瘤细胞的表型可能 向胃癌干细胞的方向发生偏移，并表达R e x - 1 、N a n o g 等维持干细胞“干”性的 表面标记。 4 军医进修学院博士学位论文 S t r e s sr e l a t e dh o
15、r m o n er e s u l t si nt h ep h e n o t y p eo f g a s t r i c C a n C e r s t e mc e l lb yb r e a k i n gt h eh o m o s t a s i s b e t w e e nC D 4 4a n dm i R N A3 7 3 A b s t r a c t C a n c e rs t e mc e l l s ( C S C s ) h a v eb e e nd e f i n e da sa u n i q u es u b p o p u l a t i o ni
16、nt u m o r s t h a tp o s s e s st h ea b i l i t yt oi n i t i a t et u m o rg r o w t ha n ds u s t a i nt u m o rs e l f - r e n e w a l A l t h o u g hc o m p l i c a t e da n dc o n t r o v e r s i a l ，t h es t e mc e l la st h ep r o g e n i t o ro f c a n c e rh a s f o u n ds u p p o r ti nl e u k e m i ar e s e a r c h ，a n ds u b s e q u e n t l yi ns o m es o l i dt u m o r s T a k a i s h i h a v e
