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1、中南大学 博士学位论文 岩静脉离断动物模型的建立及岩静脉离断对兔脑组织的影响 姓名：成磊 申请学位级别：博士 专业：外科学（神经外科） 指导教师：袁贤瑞 20100501 博士学位论文中文摘要 摘要 背景1 9 2 9 年，D a n d y 教授在其文章中插图展示了一支走行于桥 小脑角区域并经三叉神经背侧汇入岩上窦的静脉，此静脉便是后来众 所周知的岩静脉。岩静脉是非常重要且相对恒定的解剖标志，在涉及 天幕以及桥小脑角区病变的手术中扮演重要角色。 袁贤瑞教授回顾2 0 0 4 年6 月至2 0 0 7 年1 0 月进行的听神经瘤手 术3 3 例，其中2 例手术中岩静脉被电凝处理，3 1 例保护
2、良好。3 1 例 岩静脉保护良好的患者术后恢复良好，2 例电凝处理岩静脉的患者继 发小脑出血性梗死并水肿；l 例死亡，1 例经后颅窝减压后病情好转。 因此，袁贤瑞教授认为手术中应当妥善保护岩静脉，这一观点得到很 多学者的支持；但亦有部分学者认为手术中离断岩静脉对术后效果影 响不大。目前，文献中未查及关于岩静脉的动物实验研究。 目的建立家兔单侧岩静脉离断( 双极电凝烧灼后，显微剪剪断) 动物模型，观察岩静脉离断后家兔脑组织病理结构、含水量、钠钾离 子含量、S O D 活力、M D A 含量及, A Q P - 4 转录与表达。 方法1 选用健康家兔1 0 只( 雌雄不限) ，解剖分离其颈动脉及
3、颈静脉，应用硅橡胶对新鲜家兔尸头进行灌注。解剖观察灌注好的家 兔尸头标本，比较家兔与人类岩静脉的解剖结构。2 健康成年家兔1 4 4 只随机分成两组，即假手术组与岩静脉离断组。每组按处死时间点即 手术操作后4 h 、8 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 分成六个亚组，每个亚组 1 2 只家兔。每个亚组中取6 只获取标本后，干湿重法检N d , 脑及脑 干组织含水量；原子火焰吸收分光光度法检测钠钾离子含量；黄嘌呤 博士学位论文 中文摘要 氧化酶法检测S O D 活力；硫代巴比妥酸( T B A ) 法检测M D A 含量，R T P C R 检测A Q P 一4 m R
4、 N A 转录。亚组中另外六只采用H E 染色、尼氏染色及电 镜观察脑组织病理结构改变；免疫组织化学检测A Q P 一4 蛋白表达。 争士甲 ：日木 1 家兔尸头灌注血管色泽鲜艳，细小血管显示良好，解剖结构保 留完整，其岩静脉解剖结构与人类相似。 2 含水量及钠钾离子含量：A 小脑组织：假手术组各亚组脑组织 含水量、钠钾离子含量无统计学差异( p O 0 5 ) ：岩静脉离断后4 h 、 8 h 、1 2 h 、2 4 h 组脑组织含水量、钠离子含量高于假手术组( p 苏木素染液 S i g m a 公司 ( 3 ) 伊红染液S i g m a 公司 ( 4 ) 焦油紫S i g m a 公司
5、 ( 5 硫酸庆大霉素注射液( 2 m l ：8 万单位) 湖北天药药业股份有限公司 ( 6 ) 氯化钠注射液( 5 0 ( 0 1 )四川科伦药业股份有限公司 ( 7 ) 吸收性明胶海绵金陵药业股份有限公司 博士学位论文第二章 ( 8 ) 多聚甲醛 ( 9 ) 中性树胶 ( 1 0 ) 二甲苯 ( 1 1 ) 乙醇消毒液 ( 1 2 ) 络合碘 ( 1 3 ) 骨蜡 ( 1 4 ) 钠标准液l m m o l L ( 1 5 ) 钾标准液l m m o l L ( 1 6 ) N a ：H P 0 4 1 2 H ：0 ( 1 7 ) N a H ：P 0 4 - 2 H ：0 ( 1 8
6、) N a C L ( 1 9 ) K C L ( 2 0 ) K 8 ：P 0 4 2 1 3 主要仪器 ( 1 ) O P W IP i c o 型手术显微镜 ( 2 ) 康威C V 一2 0 0 0 高频电刀 ( 3 ) Y B - D X 2 3 D 型电动吸引器 ( 4 ) A B l 0 4 型电子天平 ( 5 ) F N 2 0 2 一l 型电热恒温干燥箱 ( 6 ) B H Z 型光学显微镜 ( 7 ) H 7 5 0 0 型透射电镜 ( 8 ) L K B l1 8 0 0 修块机 ( 9 ) L K B 一型超薄切片机 ( 1 0 ) 超低温冰箱 ( 1 1 ) 神经外科显
7、微手术器械： ( 1 2 ) X Y 4 0 2 型原子吸收火焰分光光度计 天津市化学试剂研究所 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 长沙雨花消毒药业有限公司 湖南湘雅集团有限公司 强生( 中国) 医疗器材有限公司 北京化工厂生产 上海试剂一厂生产 国药集团化学有限公司 国药集团化学有限公司 国药集团化学有限公司 国药集团化学有限公司 国药集团化学有限公司 C a r lZ E I S S 公司 北京市康威电子技术开发公司 上海医疗器械工业( 集团) 公司 瑞士M E T T L E RT O L E D O 公司 长沙仪器仪表广 日本O l y m p u s 公司 日本 瑞典 瑞典 美国S
8、 o L o we n v i r o n m e n te q u i p m e n t 上海金钟显微器械公司 沈阳分析仪器厂 博士学位论文 第二章 2 1 4 方法 2 1 4 1 实验动物分组 成年健康家兔，共1 4 4 只。将动物按体重顺序编号后查随机数字表分为2 组，即假手术对照组( 简称为对照组) 7 2 只、岩静脉离断组( 简称为实验组) 7 2 只。此两组按处死时间点艮p 岩静脉离断后4 小时、8 小时、1 2 小时、2 4 小时、 4 8 小时、7 2 小时分成6 个亚组，每组1 2 只。根据获取标本处理方式不同，每个 亚组随机分成A 、B 两组，每组6 只，A 组相应时间
9、点处死后取脑组织做脑含水 量、钠、钾离子含量检测；B 组于相应时间点处死后制作切片进行光镜、电镜观 察。 2 1 4 2 实验动物处置 各组用过量戊巴比妥钠处死动物，断头后迅速无菌开颅取脑组织，观察大体 形态。滤纸轻拭表面液体，取样作各项指标测定。取脑组织标本后，解剖动物查 看内脏有无疾病，雌兔是否有孕。凡是出现下列情况的动物均被废弃：( 1 ) 心、 肝、肾等内脏异常。( 2 ) 雌兔有孕。( 3 ) 未到处死时间死亡。 2 1 4 3 模型制作 ( 1 ) 术前准备 实验动物术前晚控制饮食，术晨禁食、水。手术器械应用7 5 乙醇溶液浸 泡1 小时( 乙醇液2 厨更换一次) ，用前使用无菌生
10、理盐水冲洗。 ( 2 ) 麻醉 耳缘静脉注射3 戊巴比妥钠溶液( 3 0 m g k g 。 ( 3 ) 手术操作 动物麻醉成功后，俯卧位固定于专用兔手术台上，保温毯维持体温，直肠内 插入温度计，维持体温在3 8 3 9 。兔头下方垫自制托架，使兔鼻尖稍指向前下， 枕外粗隆位于最高点。剪去术野的毛发，无菌纱布擦干局部，络合腆消毒，铺无 菌巾。自枕外粗隆喙侧t c m 处向尾侧作长约4 c m 纵形直切口，显微镜下找寻“白 线“ 。分离右便l J 肌阿，外至乳突，下至枕骨大孔。自帛l J 拉钩将肌肉以及皮肤向外 侧拉开。显微镜下磨钻磨除枕部骨质，形成骨窗。骨窗边界：外界显露乙状窦边 缘：内界稍过
11、中线；喙侧界显露横窦下缘；尾侧界至枕骨大孔( 图2 4 ) 。显露 硬膜，去除硬膜与骨质之间的脂肪组织。妥善止血后挑开硬膜，硬膜“十“ 字形 博士学位论文第二章 剪开( 图2 - 5 ) 。模仿幕下小脑上入路显露岩静脉，于小脑表面覆盖无菌橡胶薄 片以隔热，双极电凝岩静脉后予以剪断( 图2 - 6 ，图2 7 ) 。术毕，庆大霉素生理 盐水( 1 6 0 u m 1 ) 冲洗术腔，观察无出血及异物残留后，硬膜复位，明胶海绵覆 盖，骨蜡封闭骨窗( 图2 - 8 ) 。7 号手术丝线分层缝合肌肉及皮肤。7 5 乙醇擦 洗伤口。假手术组显露但不离断岩静脉，余操作同手术组。 ( 4 ) 术中、术后处理
12、术毕所有实验动物腹腔注射庆大霉素生理盐水6 m l K g ，旨在补充液体以及 预防感染。术后置于含食物与水源的笼中分笼饲养，观察进食及一般情况。术后 常规用络合碘消毒切口，未额外使用抗生素。 2 1 4 4 标本采集方法 分别于岩静脉离断之后4 小时、8 小时、1 2 小时、2 4 小时、4 8 小时、7 2 小时观察结束时间点采集标本。采集方法：动物断头后，立即开颅，完整取出兔 脑，用滤纸吸除脑表面水分及血渍，在冰盘上分别于右侧小脑与脑干区取脑组织 块，分三部分：第一部分，电子天平测湿重后置入瓷坩锅、置于- 2 0 冰箱中保 存，待作脑含水量和钠、钾含量检测用；第二部分，装入E P 管，置
13、于液氮中保 存，用于检测A Q P - 4 m R N A 转录；第三部分，置于液氮保存，用于超氧化物歧化酶 活力以及丙二醛含量检测。 病理标本的采集：麻醉家兔( 耳缘静脉注射3 戊巴比妥钠3 0 m g k g ) 后， 开胸自左心室以多聚甲醛一戊二醛混合液作为固定液进行灌注( 1 0 0 0 m l k g ) ，灌 注完成后，动物放置卜3 小时，头骨侧面开窗，断头至于新鲜固定液内，于冰箱 保存固定过夜。用于病理形态学检测。 2 1 4 5 观察指标及检测方法 ( 1 ) 小脑及脑干脑组织含水量( W C ) 测定 应用过量戊巴比妥钠于相应时间点处死家兔，迅速开颅取脑组织，去除皮层 表面的
14、软脑膜，取右侧小脑及脑干组织置于称量杯中。电子分析天平称重后( 从 开始取脑至第一次称重完毕控制在5 分钟内) ，放入电热恒温干燥箱内1 0 4 - 1 I O 。C 烤2 4 h 至恒重后称干重( 两次干重之差兰0 2 m g ) 。根据E lli o t t 公式计算脑组织 含水量。计算公式如下：脑含水量( ) = ( 湿重一干重) 湿重1 0 0 。 ( 2 ) 原子吸收火焰分光光度法检测脑组织N a + 、K + 含量 博士学位论文第二章 钠标准曲线的建立：用钠标准液配制各标准系列，原子吸收火焰分光光度计 在入= 5 8 9 n m 处分另I J 测其消光值( A ，求出其消光值与钠浓
15、度( C ) 的直线回归方程。 钾标准曲线的建立：用钾标准液配制各标准系列，原子吸收火焰分光光度计 在入= 7 6 6 5 n m 处分另l J 测其消光值( A ) ，求出其消光值与钾浓度( C ) 的直线回归 方程。 N a + 、K + 含量的测定：取己称过干重的脑组织样品，置于浓硝酸l m L 中消化过 夜，用浓高氯酸2 m L 加热消化至白烟尽，再用含3 碳酸鳃的3 浓硝酸溶解定 容至5 m L ，然后用分光光度计以不同波长分别测N a + 、K + 消光值。 ( 3 ) 小脑及脑干脑组织病理形态学检测 光镜 H E 染色 取经固定后的组织块，常规石蜡包埋，4um 切片 ( 1 )
16、切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯( I ) 5 m i n - - - 二甲苯( I I ) 5 m i n 1 0 0 乙醇2 m i n - - 9 5 乙醇l m i n - - - - 8 0 乙醇l m i n - - 7 5 乙醇1 m i n 一蒸馏 水洗2 m i n ( 2 苏木素染色5 m i n ，自来水冲洗 ( 3 ) 盐酸乙醇分化3 0 s ( 提插数下) ( 4 ) 自来水浸泡1 5 r a i n 或温水( 约5 0 ) 5 m i n ( 5 伊红液浸泡2 m i n ( 7 ) 常规脱水，透明，封片：9 5 乙醇( I ) l m i n 一9 5 乙醇( I I l m i n - - 1 0 0 乙醇( I ) l m i n 1 0 0 乙醇( I I ) l m i n - - - “ 甲苯：石碳酸( 3 ：1 ) l m i n - - - 甲 苯( I ) l m i n - - - 二甲苯( I
