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1、API 4000 串联四级杆质谱仪基础培训,龚楚婷,一、API 4000基本结构,1、整体图 2、Agilent液相 样品引入系统 （自动进样器器、针泵） 3、离子源,1、API4000基本结构,1、API 4000基本结构,样品引入,离子化,质量分析,2、液相-Agilent1200系列,溶剂箱,真空脱气机,二元泵,自动进样器,恒温箱,柱温箱,自动进样器,6,9,1,6,7,13,12,54,样品引入方法,连续进样，针泵推样品，提供准确的低流速。允许连续的样品引入以便仪器的调谐和优化。 分流进样，使用针泵和LC系统化离子源和化合物参数。 流动注射进样（FIA）,没有柱子的情况下，使用LC高通
2、量的优化液相参数。 液相色谱，使用LC在宽的流速范围下，分离、分析混合物,3、离子源,3.1 离子源体,离子源体是TIS 和APCI共用的,TIS和APCI的互换不用工具,只用手就可以完成. 放电针位置调节钮,单手操作即可 放电针一直在离子源体内,3.2 probe Turbolonspray probe,APCI probe,二、基本知识,1、选择合适的离子源 2、仪器接口 3、离子传输通道 4、离子检测器,1、选用合适的离子源,电喷雾 - TurboIonSpray,TIS 工作原理同EI,不同的是TIS有辅助加热气(GS2),可加快去溶剂的速度 可用于比较大的液体流量 缺点：基质抑制现象
3、较为明显；放电现象,APCI 三步离子化的过程: 电晕针放电使离子源内的 N2 或 O2 带电 N2 或 O2 转移电荷到气态溶剂分子上 带电的气态溶剂分子转移电荷到气态样品上 适合分析分子量小于2000Da的样品 缺点：有可能发生热裂解；,大气压化学电离源 (APCI) 又叫:加热雾化源 Heated Nebulizer,TurbolonSpray离子源,针电压 正离子：1500到5500V 负离子：-1500到-4500V 温度（TEM） 高流速需要高的温度，最高到750度 流速 10-3000L/min 最优化：200-500L/min 溶剂 在正离子模式下，铵盐的浓度在2-10mmol
4、/L，在负离子模式下为2-50mmol/L。 酸性添加剂的浓度为0.1%-0.5%,参数优化,高含水比例的流动相需要更高的温度和气流，离子源温度太低时易形成溶剂簇离子 气帘气在不影响灵敏度的前提下可设定较高值，保障仪器的抗污染及方法的重现性,APCI加热喷雾器指南,加热喷雾器是高流速入口 电晕针位置：稍偏离探针，对准孔 缓冲液/添加剂不需要离子化 挥发性缓冲液最高50mM 极性大的化合物可能降低极性低的化合物的灵敏度，比如TFA正离子模式下从分析物那里夺走电荷 流速：0.1-3mL/min 最优化：*-1mL/min,参数优化,2、API 4000 仪器的接口,流速大时，增大curtain g
5、as，抗污染、助汽化,3、API4000的离子传输通道,DP：加在小孔板上的电压，用于打断样品离子与溶剂分子间的化学键，使样品离子分离出来 EP：加在Q0上的电压，聚焦离子束，调节离子束能量和速度 DF：离子束偏转电压，加在检测器前方使离子束进入检测器 CEM：检测器放大电压，有最佳值，电压数值越大检测器寿命越短,常见的加合离子 正离子方式常出现如下离子: -Na 22 Da. higher than M+H -K 38 Da. higher than M+H -Li 9 Da. higher than M+H -NH4 17 Da. higher than M+H -ACN 40 Da. h
6、igher than M+H 2M+H,2M+Na等 负离子方式常出现如下离子: -TFA 114 Da. higher than M-H (113 and 227 background) -Acetate 60 Da. higher than M-H -Formic 46 Da. higher than M-H -Cl 36 Da. higher than M-H,LC-MS中常见的本底离子, ,m/z 15-150, 溶剂离子，(H2O)nH+ ，n= 3-112 m/z 102, H+乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+,102.0549 m/z 149, 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐, C8
7、H4O3H+,149.0233 m/z 288, 2mm 离心管的产生的特征离子 m/z 279, 管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591 m/z 316, 2mm 离心管的产生的特征离子 m/z 384, 瓶的光稳定剂产生的离子 m/z 391, 管路中邻苯二甲酸二辛酯, C24H38O4H+, 391.2843 m/z 538, 乙酸+氧 +铁（喷雾管）, Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793,三、仪器使用,1、开机 2、Analyst软件基本操作 3、关机 4、操作注意事项、日常维护,1、开机,1. 开气：Exhaust Gas、Curtain Gas
8、、Gas 1/Gas 2，压力约为0.4bar、0.4bar、0.6bar。 2. 打开机械泵上的电源开关，机械泵继续工作至少15分钟。 3. 打开仪器电源主开关（主机右侧），涡轮分子泵开始运行，抽真空。 4. 等系统真空到达1-2x10-5Torr（Analyst软件右下角的质谱图标有显示）后才可以正常操作仪器扫描。 5. 打开空气压缩机。 6. 打开电脑开关，进入Windows 桌面，双击Analyst ，进入Analyst分析界面。 注意： 以上操作程序适用于停机时间少于24-48小时的仪器或配置TW700分子泵的API4000在仪器安装或TW700分子泵更换后的首次开机操作。,2、An
9、alyst软件基本操作,2.1 软件使用者界面 2.2 软件模块 2.3 常规定量分析流程 2.4 不定期做质量校正 2.5 柱后灌流介质效应 2.6 抬针 2.7 信噪比 2.8 采样点数 2.9 计算器 2.10 overlay 2.11 添加时间段和实验 2.12 工具栏常用图标,2.1 Analyst软件使用者界面,模块列表,项目目录,导航条 系统状态,2.2 软件模块 Configure(配置) 设置硬件、安全和报告配置 Tune and Calibrate(调谐) 手动、自动校准仪器和调谐方法 Acquire(采集) 设置采集方法和批文件的建立 Explore(浏览) 处理数据文件
10、 Quantitate(定量) 数据定量,2.2.1 配置模块,安全性配置 硬件配置 报告模板编辑,2.2.1.1 配置模块 安全,2.2.1.2 配置模块 硬件 创建仪器配置 的硬件文件 加上不同的外 围设备和其他 应用 每个设备独自 建立,2.2.1.3 配置模块报告模板,1、header、footers设计各分6个areas，上下及左中右 可设定fonts、justification 2、page setup页面设定 3、单击选择修改的区域 4、选左边列表的项目 5、单击将项目送达或移除 选中保证使用者可以在各自的项目中调用此模板,1,2,3,4,5,竖直,水平,2.2.2调谐模块,可用
11、为: 调谐仪器 检测方法 手动采集 检测 LC流速和背景,2.2.3 采集模块,Information Dependent Acquisition 编辑采集方法 编辑采集序列 快速审阅,2.2.3.1 浏览模块处理数据文件,2.2.4 定量模块,建立定量方法 定量 结果列表,2.3 常规定量分析流程,新建Project,2.3.1 激活硬件,此处激活MS ONLY 优化完质谱参数后，deactivate MS ONLY，激活LC MS，优化其他参数,2.3.2 流动注射,设置 确认 运行,喷雾针垂直距离设为5-7cm 正离子：5ml/min 负离子：10ml/min,2.3.3 Q1 SCAN
12、确定母离子的质荷比 根据待测化合物性质，选择分析的极性(/)、 离子化方式(ESI/APCI)，根据分子量选择扫描范 围和时间 确定母离子的质荷比，准确到小数点后一位。 参数设置： 扫描方式：Q1 Scan 质量范围： Parameter Range，100MW+30，t=12sec(200Da/s) Center Width，MW5Da，t=0.5sec 通过手动调节DP、EP，使喷雾平稳、有效,确定母离子,流动注射泵进样，调谐模式manual tuning，先parameter range确定母离子范围，再centre/width确定精确m/z值 信号强度在 2e5 到1e6 之间，波动在
13、15%以内比较合适 点击Acquire 采集 Q1 单级质谱数据并存盘，取名：样品名（英文）-SCAN 多个母离子可以选Q1 Multiple Ions,信号强度不要低于e4，不要超过e6，否则损伤电子倍增管，减少寿命！ 扫离子一般200Da/s，也可以适当减少每秒扫描次数，增加扫描准确度。 提供扫离子的图：,优化参数-结果,2.3.4 Product Ion Scan -确定子离子的质荷比 得到高质量的MS图，母离子的强度为图谱中基 峰强度的1/3到1/4为宜 平滑后选择子离子质荷比，确定到小数点后一位 （允许有0.2Da的误差） 参数设置 扫描方式：Product Ion Scan 质量范
14、围： Parameter Range，50MW+10，t=12sec 通过手动调节CE、CXP,确定子离子,MCA ON，Acquire 采集数据并存盘 取名：样品名-PI,2.3.5 优化化合物参数 根据前面选出的母、子离子，组建MRM离子对 选择多个离子对时，应合理分配每一对的分析时 间 用“Ramp”，优化Compound项下各参数，以及 Source项下CAD、CUR、GS1、GS2、IS、TEM、Interface Heater参数。各离子对应分别设定。 初步建立MRM方法 一般优化两次，以得到比较确切的结果,把混合物中的所有离子对输入MRM方法中存盘，优化过程完成,2.3.6 方法
15、转化：将连续进样方法LC-MS方法 将 HPLC 系统连接好，不接柱子，不连流动注射泵，将液相色谱泵与TIS 离子源连好 关掉所有质谱分析界面，将现有质谱体系灭活，激活液质联用设备，在调谐的模式下。 单击Acquire中Build Acquire Method，打开上面保存过的MRM方法，添加设备：色谱泵、自动进样器等。 设置色谱同步。 设置色谱参数，分析时间一般为0.61min，流动相组成和流量与实际样品分析时相同；修改质谱分析时间，与色谱参数一致； 设置GS1、GS2、TEM初始值为40、40、400左右，保存方法，例如：LC-MRM.dam。,连液相，优化,2.3.7 FIA-优化Sou
16、rce参数 将前面用过的样品溶液稀释1001000倍。 在Tune项下，双击Compound Optimization，选 择FIA分析 根据向导进行自动优化。不接色谱柱进行FIA定量 优化 注意：需要优化的各可选值之间用“;”分隔。 当对源参数含义及设置比较清楚后，可以省略此 步。,FIA优化参数,2.3.8 色谱条件优化 接好并平衡色谱柱，用适当浓度标准品考察分离 情况 根据色谱分离情况，设定梯度洗脱(平衡较慢) MRM方式可以不必所有峰都基线分离，但要注意 避开基质离子抑制的干扰 调整色谱流动相组成和流速，并相应调整源参数, ,空白基质添加标准品，稀释成不同浓度 根据LC流动相组成，选择稀释
