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1、青岛大学 博士学位论文 姜辣素在新型水貂呕吐模型的作用及机制 姓名：钱秋海 申请学位级别：博士 专业：生理学 指导教师：岳旺 20100521 一王750 8 87 摘要 目的： 呕吐是胃内容物返入食道，经口吐出的一种反射动作。呕吐可将进入胃内的有 害物质吐出，是机体的一种防御性反射，有一定保护作用。但多数情况下，呕吐是 一种存在于多种疾病或条件下的难以忍受的症状。一般分为反射性、中枢性、前庭 障碍性、神经官能性四大类呕吐，涉及几十种疾病，尤其是癌症放化疗可诱发患者 出现频繁剧烈的呕吐，引起脱水、电解质平衡紊乱等并发症，使病人的生活质量明 显下降，影响了癌症患者治疗的依从性。因此，如何有效防治
2、放、化疗呕吐成为多 国科学家研究的重要课题。 现临床止吐药主要是化学类药物，如组胺、胆碱、多巴胺、S P 等受体拮抗剂， 作用靶点单一，副作用大，亟需探索天然、低毒、广谱、多靶点止吐药。 中药生姜被称为“呕家圣药”，治疗呕吐疗效确切历史悠久，已有2 0 0 0 多年的 历史。姜辣素( g i n g e r o l s ) 是生姜中主要活性成分，探讨姜辣素止吐作用及其机制， 可为揭开生姜止吐之谜和g , J S U 新型止吐药物提供新思路。 本文运用新型水貂呕吐模型和经典大鼠异嗜模型，从中枢和外周两个角度，器 官和细胞两个水平，从三个方面研究姜辣素作用机制：姜辣素在水貂急性呕吐模 型的作用及对
3、5 - H T 、D A 及S P 表达的影响；姜辣素在水貂延迟性呕吐模型的作 用及对N K l 受体表达的影响：姜辣素在大鼠异嗜模型的作用及对c 1 0 s 、N K l 受体 及胆囊收缩素( C C K ) 、降钙素基因相关肽( C G R P ) 、胃动素( M T L ) 的影响。 方法： 1 姜辣素在水貂急性呕吐模型的作用及对5 - H T 、D A 及S P 表达的影响： 将水貂随机分为6 组( n = 6 ) ：空白对照组、模型对照组、恩丹西酮阳性 对照组、姜辣素小剂量组、姜辣素中剂量组、姜辣素大剂量组。观察顺铂注 射后6 h 内的呕吐指标，包括呕吐潜伏期，干呕，呕灶次数。并在6
4、 h 观察期结束后， 取极后区脑组织及距幽门2 0 c m 处回肠组织，采用高效液相色谱法测定外周及中枢 5 H T 及D A 表达，免疫组化方法测定外周及中枢S P 表达。 2 姜辣素在水貂延迟性呕吐模型的作用及对N K - 受体表达的影响： 分组与给药同前，观察顺铂给药后7 2 h 内的呕吐指标，记录干呕次数及呕吐次 数。7 2 h 观察期结束后，取极后区脑组织及距幽门2 0 c m 处回肠组织，采用免疫组化 方法及W e s t e r n b l o t 方法测定姜辣素对水貂外周及中枢N K l 受体表达水平的影响。 3 姜辣素在大鼠异嗜模型的作用及对c - f o s 、N K l
5、受体、C C K 、C G R P 、M T L 的影响： 将大鼠随机分为8 组( n = 6 ) ：正常动物+ 生理盐水组、正常动物+ 姜辣素组、 模型对照组、阿瑞吡坦对照组、恩丹西酮对照组、姜辣素小剂量组、姜 辣素中剂量组、姜辣素大剂量组。观察各组给药后7 2 h 内异嗜高岭土行为，每6 小时观察和记录大鼠进食高岭土量。在7 2 h 观察期结束后腹主动脉取血，并立即分 别截取大鼠极后区脑组织和距幽f - j1 5 c m 处的回肠组织。分别采用免疫组化方法测 定姜辣素对外周及中枢c f o s 表达的影响；R T - P C R 方法测定姜辣素对外周及中枢N K l 受体表达的影响；放免法
6、测定姜辣素对血浆C C K 、C G R P 、M T L 表达的影响。 结果： 1 姜辣素在水貂急性呕吐模型的作用及机制研究： 顺铂给药( i p ) 后，模型组6 只水貂6 h 内均发生呕吐，呕吐潜伏期短，干呕和 呕吐次数均增多；而姜辣素大、中、小三个剂量组干呕及呕吐次数均减少，呕吐潜 伏期增加，与模型对照组比较差异显著( P 0 0 5 ) 。 2 姜辣素在水貂延迟性呕吐模型的作用及机制研究： 顺铂给药( i p ) 后，模型对照组水貂在2 4 h 急性呕吐期和2 4 7 2 h 延迟性呕吐期 均有干呕和呕吐反应。姜辣素大、中、小三个剂量在2 4 h 急性呕吐期和延迟性呕吐 期干呕及呕吐
7、次数均减少( P 0 0 5 ) 。 免疫组化和W e s t e r n b l o t 测定结果表明：水貂回肠组织与极后区脑组织中N K l 受体表达增高( P O 0 5 ) 。 1 姜辣素对水貂急性呕吐模型D A 的影响 顺铂能诱导水貂脑干极后区及回肠中D A 含量增高，姜辣素不仅降低回肠中D A 也降低脑干极后区D A 的含量，结果表明姜辣素能够抑制顺铂导致的回肠及大脑极 后区D A 过量分泌。姜辣素之所以能够抑制回肠及大脑极后区D A 过量分泌，可能 是抑制了外周胃肠D A 分泌，进而使迷走神经传入到中枢极后区的信号也相应减弱， 导致极后区D A 分泌以及与D A 受体的结合减少；
8、也不能排除姜辣素直接作用于中 枢，抑制极后区D A 释放并抑制D A 受体有关，有待进一步实验加以证明。 2 姜辣素对水貂急性呕吐模型5 - H T 的影响 顺铂可致水貂回肠组织和极后区组织5 H T 表达增高，应用姜辣素后可同时降 低外周回肠和脑干极后区5 - H T 含量增高，且对于脑极后区5 - H T 的降低作用更加明 显。而5 H T 3 受体拮抗剂恩丹西酮仅能抑制脑干极后区5 H T 分泌，对外周组织5 - H T 表达无抑制作用，这点与S c a r a n t i n oC W 等的研究报道相吻厶【6 2 J 。思丹西酮主要是 通过拮抗5 H T 3 受体，使传到中枢极后区的信
9、号减弱最终致使极后区5 一H T 分泌减少。 而姜辣素对5 H T 系统的作用可能与姜辣素拮抗外周和中枢组织5 - H T 的分泌、抑制 5 - H T 受体的表达、抑制5 - H T 与受体结合有关，尚待实验进一步予以证明。 3 姜辣素对水貂急性呕吐模型S P 的影响 顺铂可诱导水貂回肠组织及极后区组织S P 增高，应用姜辣素后，外周回肠组织 和极后区脑组织中S P 表达均降低，而恩丹西酮对照组对回肠及极后区脑组织中升高 的s P 水平均没有降低作用。表明姜辣素抗呕吐机制与抑制外周胃肠和中枢脑极后区 S P 分泌有关。同时其抗呕吐作用还可能与抑制S P 与N K l 受体结合相关。 本文在顺
10、铂诱发的水貂呕吐模型中，证明顺铂可增加水貂急性呕吐模型外周及 中枢D A 、5 - H T 及S P 的表达，表明其机制涉及多靶点；而姜辣素可对抗化疗呕吐， 对外周回肠组织和中枢极后区组织异常增高的D A 、5 - H T 、S P 均有抑制作用。结果 说明姜辣素治疗急性化疗呕吐与D A 、5 H T 、S P 三种递质有关。 2 4 青岛大学博士学位论文 第二章姜辣素在水貂延迟性呕吐模型的作用及对N K l 受体 表达的影响 恶心呕吐按照发作的时间不同可分为3 类：一、急性恶心呕吐，指应用化疗药 后2 4 小时内发生的呕吐，多在细胞毒药物用后1 2 小时内出现，5 - 6 小时达到高峰， 该
11、类型恶心呕吐程度最为严重。二、延迟性恶心呕吐，指应用化疗药后2 4 小时后出 现的恶心呕吐。其中4 0 5 0 发生于化疗后2 4 4 8 小时，有时可持续5 7 天，其严 重程度多较急性恶心呕吐轻，但往往持续时间较长，对患者营养状况及生活质量影 响较大。三、预期性恶心呕吐，指应用化疗药之前发生的呕吐，精神紧张往往是导 致此类呕吐发生的主要原因。 P 物质( S P ) 与N K l 受体的研究成为新近呕吐研究新的热点，而N K l 受体拮抗剂 的开发成为放化疗止呕药物新的里程碑。S P 与N K l 受体存在于中枢神经系统和胃肠 道，不但参与急性呕吐，而且参与延迟性呕吐，因此抗呕吐作用广泛。
12、N K l 受体拮 抗剂不仅对于延迟性呕吐效果良好，对急性呕吐也有较好作用，弥补了5 - H T 3 受体 拮抗剂仅对急性呕吐有效而对延迟性呕吐无效的缺陷，因而引起了医疗界的极大关 注。但是此类药物仍存在着作用靶点单一，毒副反应较大，价格昂贵，安全性与疗 效尚需观察。因此开发一种新型的，多靶点、低毒，安全有效的止呕药物成为目前 抗呕吐研究领域亟待解决的重要课题。 第一章已证实姜辣素在水貂急性呕吐模型有止吐效果，可通过抑制中枢及外周 组织异常增高的D A 、5 - H T 及S P 等多靶点起作用，但尚未对水貂延迟性呕吐作用 和新的呕吐作用靶点N K l 受体作用进行研究。本文用新型水貂呕吐模型
13、，采用传统 药理学与现代分子生物学方法相结合，从外周和中枢两个角度，采用免疫组化、 w e s t e n b l o t 等方法，测定姜辣素在水貂延迟性呕吐模型的作用及对N K l 受体表达的 影响。 1 材料 1 1 动物 水貂，健康成年，黑色，雄性，体重1 3 1 8 k g ，由青岛市特种动物饲养中心提 供，每只动物均单独置于7 5 c m X 5 0 c m 5 0 c m 的铁笼内，2 4 h 自然光照射，实验前自 由进食饮水。 1 2 药品 1 2 1 观察组用药：姜辣素，宝鸡市虹源生物科技有限公司，批号：2 0 0 5 0 7 1 2 2 3 ，用 质量分数为1 的西黄蓍胶助溶
14、，实验前室温下新鲜配制成质量浓度为1 0 、2 0 、4 0 9 L 。 1 2 2 对照组用药：恩丹西酮：齐鲁制药有限公司批号：2 0 0 5 0 3 0 0 32 m l ：4 m g ； 第二章姜辣素在水貂延迟性呕吐模型的作用及对N K l 受体表达的影响 1 2 3 模型致呕剂：顺铂，齐鲁制药有限公司批号：0 5 0 7 0 1 2 22 0 r a g 支；加生理盐 水在温水( 5 0 ) 新鲜配制，每7 5 m g 顺铂溶于l m l 生理盐水中，待冷至3 7 。C 左右行 腹腔注射。 1 2 4 助溶剂：西黄蓍胶粉，中国医药上海化学试剂公司，批号F 2 0 0 5 0 31 6
15、，使用时 西黄蓍胶1 0 9 加双蒸水9 9 0 9 ，室温下配成质量分数为1 的西黄蓍胶溶液。 1 3 试剂 免疫组化方法所用试剂： ( 1 ) 一抗A n t i - N K Ir e c e p t o r 北京博奥森生物技术有限公司，批号b s 0 0 6 5 R ； ( 2 ) S P - 9 0 0 0H i s t o s t a i n T M - P l u sk i t s 免疫组化染色试剂盒北京中杉金桥生物技 术有限公司，批号2 0 0 7 0 9 2 1 ； ( 3 ) 浓缩型D A B 试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司，批号2 0 0 7 1 0 2 1 。 1 4
16、 仪器与设备 1 4 1 免疫组化方法所用仪器 ( 1 ) L X J I I 型离心机，上海第二分析仪器厂生产，批号：1 9 9 8 0 3 2 5 A ( 2 ) L E I C AA S P 3 0 0 全自动生物脱水机，L E I C A 公司生产 ( 3 ) A S P 2 1 3 5 病理切片机，批号：1 9 9 9 0 3 2 1 B ( 4 ) G a l a n z 微波炉，O L Y M P U S 公司 ( 5 ) 医学图像分析系统，型号H P I A S l 0 0 ，同济医科大学千屏影像工程公司 ( 6 ) C K X 4 1 3 2 P H 型光学显微镜，O L Y M P U S 公司 1 4 2W e s t e r n b l o t 方法所用仪器 ( 1 ) J Y l 0 0 0 1 电子天平，上海精密科学仪器厂 ( 2 ) M D F 3 9 2 8 6 。C 超低温冰箱，日本S A N Y
