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1、1 8 1 2 0 1 3 0 河北医科大学 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。 本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所 有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表 与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试 验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。 否则，承担相应的法律责任。 研究生签名：磊冬b 燧章：新沈二级学院领导盖章：i 山p 年岁月；日 河北医科大学 研究生学位论文独创性声明 本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了 文中特别加以标
2、注等内容外，文中不包含其他人已发表或撰写的研究 成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。 研究生签名：名臻导师签章：研究生签名：荡套导师签章： 十， 李 ? 0 乃年广月了日 目录 l I l ll lI IIUI I II I II IIIl 18 0 0 5 9 6 中文摘要1 英文摘要5 研究论文大蒜素对全脑缺血再灌注大鼠海马凋亡相关蛋白及细胞 间黏附分子一1 表达的影响 前言1 U 一 日I J 舌。l 材料与方法1 2 结果1 2 附图2 0 附表3 0 讨 仑31 结论3 2 参考文献3 3 综述大蒜素抑制脑缺血再灌注诱导细胞凋亡机制的研究进展一3 6 致谢4
3、 2 个人简历4 3 中文摘要 大蒜素对全脑缺血再灌注大鼠海马凋亡相关蛋白及细胞间 黏附分子一1 表达的影响 摘要 目的：脑缺血再灌注损伤( c e r e b r a li s c h e m i ar e p e r f u s i o ni n j u r y ，C I R I ) 的机制非常复杂，涉及到氧自由基的产生、钙超载、炎症介质释放以及细 胞凋亡等诸多因素。细胞间黏附分子1 ( i n t e r c e l l u l a ra d h e s i o nm o l e c u l e s l ， I C A M 1 ) 是一种重要的促炎因子，在缺血再灌注损伤中发挥重要作用。
4、B c l 2 ( B 细胞淋巴瘤白血病2 ，B c e l ll e u k e m i a l y m p h o m a 2 ) 、b a x ( B c l 2 a s s o c i a t e dX p r o t e i n ) 以及调亡蛋白酶半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 一3 ( C a s p a s e 3 ) 都是细胞凋亡过程中起重要作用的因子，在细胞凋亡过程中 分别发挥抑制凋亡和促进凋亡的作用。 大蒜素( A l l i c i n ，A 1 1 ) 又名大蒜新素( A l l i t r i d i ) ，其具有脂溶性，易于通 过血脑屏障，故在临床防治脑缺血以及缺血再灌注损
5、伤方面的作用倍受关 注。近些年的研究证实，大蒜素具有减少活性氧的产生、抑制钙超载、调 节机体免疫功能等多种功效。我室的研究发现，大蒜素可防止C I R I 诱导的 海马神经元发生凋亡，但其对于缺血再灌注脑组织保护作用的详细机制尚 缺乏深入的研究。因此，在我室以往研究的基础上，本实验观察了大蒜素 对C I R I 的海马组织调亡蛋白酶C a s p a s e s 3 以及调亡相关蛋白B c l 2 和B a x 的 影响，并观察了其对于脑缺血再灌注引起的I C A M 1 表达的影响，探讨大 蒜素对缺血再灌注脑组织保护作用的详细机制，为大蒜素临床应用提供实 验依据。 方法：采用健康雄性W i
6、s t a r 大鼠3 0 只，体重2 8 0 3 2 0 9 ，由河北医科 大学实验动物中心提供，将动物随机分为5 组：假手术( S h a m ) 组，缺 血一再灌注( I R ) 组，缺血再灌注+ 大蒜素1 0 m g k g ( I R + A l l - 1 0 m g k g ) 组， 缺血再灌注+ 大蒜素2 0 m g k g ( I R + A l l 一2 0 m g k g ) 组，缺血再灌注+ 大 蒜素3 0 m g k g ( I R + A 1 1 - 3 0 m g k g ) 组，每组6 只动物。 S h a m 组只凝闭双侧椎动脉，分离暴露但不夹闭颈总动脉；I
7、R 组凝闭 双侧椎动脉，4 8 h 后夹闭双侧颈总动脉8 m i n ，而后恢复血流灌注； 组动物分两次( 缺血前3 0 m i n 及再灌注后10 m i n ) 经尾静脉给予大蒜素 中文摘要 注射液，其他过程同I R 组，S h a m 组及I R 组于缺血前3 0 m i n 及再灌注 后10 m i n 给予等体积5 葡萄糖注射液。各组动物均于再灌注后2 4 h 断头 取海马组织，用于指标观察。 参照K a t o 分级方法，在光学显微镜下对海马C A l 区组织学改变进行分 级( H i s t o l o g i c a lg r a d e ，H G ) 。0 级，无神经元死亡；
8、l 级，有散在的神经元 死亡；2 级，成片神经元死亡；3 级，几乎全部的神经元死亡。取双侧海马 平均等级作为统计值。 于高倍光学显微镜下计数海马C A l 区每lm m 区段内细胞膜完整、胞 核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数3 个区段， 取平均值作为每一例的存活神经元密度值( N e u r o n a ld e n s i t y , N D ) 。 采用免疫组化方法检测C a s p a s e s 一3 、B c l 。2 、B a x 以及I C A M 1 的表达， 通过测定海马C A l 区C a s p a s e s 3 、B c l 2 、B a x 以
9、及I C A M 1 免疫反应阳 性细胞面积和积分光密度值，用于反应C a s p a s e s 3 、B c l 2 、B a x 以及 I C A M 1 表达的改变。 结果： l 大蒜素对脑缺血再灌注大鼠海马组织学分级以及存活神经元密度的影 响 S h a m 组大鼠海马C A l 区锥体细胞排列整齐，几乎无锥体细胞缺失现 象，6 例中，5 例组织学分级为0 级，仅一例为1 级。存活神经元密度值 较高。I R 组大鼠海马C A l 区神经元排列松散，有明显的细胞缺失，存留 细胞中部分细胞胞体形态不规则，呈多角型或梭型，胞膜皱缩，胞核固 缩浓染，组织学分级为l 2 级，与S h a m
10、组比较，存活神经元密度值明显 降低。I I H A l l 1O m g 组、I I i U l - 2 0 m g k g 组及I 】H A l l 一3 0 m g k g 组大鼠海 马C A l 区锥体细胞排列情况和细胞形态均较I R 组明显改善，组织学分 级均明显降低，表明组织损伤较轻，存活神经元密度值明显增加，其中以 I 爪+ A 1 1 2 0 m g k g 组改善最为明显。 2 大蒜素对脑缺血再灌注大鼠海马B c l 2 蛋白表达的影响 S h a m 组海马C A l 区B c l 2 蛋白有一定的基础表达，与S h a m 组比较， I R 组海马B c l 2 蛋白表达减
11、少，表现为阳性细胞面积减小和阳性细胞积 分光密度值降低，但与S h a m 组相比无统计学意义；与I R 组比较， I R 州U l 一10 m g k g 组、I 瓜屯U 1 2 0 m g k g 组和I 酣- A l l 一3 0 m g k g 组B c l - 2 阳性 中文摘要 细胞面积均明显增加，阳性细胞积分光密度值也明显增加，表明B c l 2 蛋 白表达明显增多，其中以I 对- A 1 1 2 0 m g k g 组B c l 2 表达增加最为明显。 3 大蒜素对脑缺血再灌注大鼠海马B a x 蛋白表达的影响 S h a m 组大鼠海马C A l 区有少量B a x 蛋白表达
12、。与S h a m 组比较，I R 组大鼠海马B a x 蛋白表达明显增加，可见大量深染的棕黄色的神经元细 胞，胞质内B a x 蛋白免疫阳性颗粒丰富，部分轴突着色，阳性细胞面积 和阳性细胞的积分光密度值均明显增加。与I R 组比较，I 刚- A 1 1 1 0 m g k g 组、I 爪+ A 1 1 2 0 m g k g 组和I 对- A 1 1 3 0 m g k g 组大鼠海马B a x 表达均明显减 少，其中以I 刚赳l 。2 0 m g k g 组的表达减少最为显著。 4 大蒜素对脑缺血再灌注大鼠海马C a s p a s e s 3 表达的影响 S h a m 组大鼠海马C A
13、 l 区C a s p a s e s 3 蛋白表达量很少，与S h a m 组比 较，I R 组则表现为C a s p a s e s 3 蛋白的高表达，细胞深染呈现深褐色，胞 质内阳性标记物丰富，部分轴突明显着色，阳性细胞面积和积分光密度值 均明显增加；与I R 组比较，I R - 卜A l l 一1 0 m g k g 组、I I H 舢l 一2 0 m g k g 组和 I I H A l l 3 0 m g k g 组C a s p a s e s 3 表达均有所减少，阳性细胞面积和积分光 密度值均明显降低，其中以I 刖- A 1 1 2 0 m g k g 组C a s p a s
14、 e s 一3 蛋白表达减少 最为明显。 5 大蒜素对脑缺血再灌注大鼠海马I C A M 1 表达的影响 S h a m 组大鼠海马C A l 区I C A M 1 仅有少量表达，与S h a m 组比较， I R 组I C A M 1 表达明显增加，表现为阳性数量增加，染色加深，阳性细 胞的面积和积分光密度值均有所增加。与I R 组比较，I R + A 】1 1 0 m g k g 组、I 酣- A 1 1 2 0 m g k g 组和I R + A 1 1 3 0 m g k g 组I C A M 一1 表达均明显减少， 表现为I C A M 1 免疫反应阳性细胞面积和阳性细胞的积分光密度
15、值均减 少，其中以I R - 嗍1 2 0 m g k g 组减少最为显著。 结论： 1 静脉给予大蒜素预处理，可使全脑缺血再灌注大鼠海马组织学改变明显 改善，存活神经元数目增加，表明大蒜素对大鼠全脑缺血再灌注海马组织 具有明显的保护作用。 2 给予大蒜素预处理可使全脑缺血再灌注大鼠海马B c l 2 蛋白表达明显增 加，B a x 和C a s e p a s e 3 表达显著较少，表明大蒜素可通过影响凋亡相关蛋 白的表达，抑制细胞凋亡而发挥脑保护作用。 中文摘要 3 本实验还证实，大蒜素预处理可使全脑缺血再灌注大鼠海马组织 I C A M 1 表达明显减少，这可能是大蒜素发挥脑保护作用的另一环节。
