《大米蛋白酶法制备抗氧化肽的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大米蛋白酶法制备抗氧化肽的研究（134页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类号 U D C 密级保蜜 编号z 兰靼! 兰! 竺7 博士学位论文 大米蛋白酶法制备抗氧化肽的研究 曹辉日叶 指导教师昱查篁数拯 申请学位级别盟专业名称壅亡品左旦王区贮蘧王程 论文提交日期星Q Q 昼生! 里旦论文答辩日期星Q Q 昼生1 2 旦 学位授予单位和日期江菱太堂星Q Q 昼生 ! ! 旦 答辩委员会主席 评阅人 2 0 0 8 年11 月 C l a s s i f i e dI n d e x ： U D C ： P h D D i s s e r t a t i o n f 0 I I I II r l r lI I I rI J I rI1 1 1 r i l l 19
2、9 4 5 9 5 S T U D YO NP R E P A R A T I o NO FA N T I O D A N TP E P T I D E SB Y H Y D R o L Y S I SO FR I C EP R o T E I N B y C a oh u i M a j o r ：A g r i c u l t u r a lP r o d u c t sP r o c e s s i n g a n dS t o r a g eE n g i n e e r i n g 一一一 S u p e r v i s o r ：P r o f W uC h u n d u P r
3、 o f M aH a i l e J i a n g s uU n i v e r s i t y N o v2 0 0 8 学位论文作者签名：指导教师签名： 2 0 0 8 年1 1 月6 日2 0 0 8 年1 1 月6 日 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名瓤 日期：2 0 0 8 年n 月6 日 和5 8 8 ；大米抗氧化肽的E 值分别为2 9 2m g m L 、2 1 7m g m L 和3 8 6m g m L 。在各自最佳反应条件下得到的三种酶的水解产物， 进行D P P H 自由基清除率和E C 5 0 值的横向比较，最终确定中性蛋白 酶为本试验用酶
4、，其最佳制备工艺参数为，底物浓度1 0 9 a 0 0 m l ，加 酶量8 ，酶解p H6 0 ，酶解温度6 0 ，时间3 0 m i n 。 在大米蛋白单酶水解实验基础上，将选出的三种酶两两组合，进 行双酶分步水解试验，发现加酶顺序对水解产物的抗氧化活性有较大 的影响；同时第一步酶解后灭酶明显优于不灭酶。最终比较得到最优 组合：大米蛋白先经中性酶水解3 0 r a i n ，灭酶后再由木瓜酶水解 1 5 m i n ，得到的酶水解产物E C s o 为1 2 3 m g m L , 与单酶相比下降了 4 3 3 。 在超声功率1 5 0 0 W 、超声初始温度4 0 条件下超声处理大米蛋白
5、 溶液2 0 m i n ，再用中性酶水解制备抗氧化肽，其D P P H 自由基清除率可 达至1 J 7 4 8 ，E C s o 为0 9 3 2m g m L 。超声处理原料使水解产物的E C 5 0 江苏大学博士学位论文：大米蛋白酶法制备抗氧化肽的研究 值比没做处理的显著下降了5 7 1 。 研究了制备得到多肽的抗氧化性能试验，发现大米抗氧化肽具有 较强的清除0 2 一、D P P H 自由基、羟自由基，其E C 5 0 分别为0 0 6 7 8m g m L 、 0 9 3 2m g m L 和0 1 1 7 m g m L 。 以7 3 2 阳离子交换树脂、S e p H a d e
6、 x G 2 5 和H P L C 制备柱纯化大 米抗氧化肽，最终研究得到两种抗氧化肽。使用美国A B I 的串联飞 行质谱仪4 7 0 0T O F T O F 对分离到的抗氧化肽进行结构分析，得到两 个多肽序列分别为G l y V a l P r o S e r 一灿a V a l S e r - A r g - A s n - M e t T h r - A r g - S e r - A r g 和L e u 一a - S e r - G l n - H i s - L e u - V a l - A l a - I l e L e u A s p - P r o P r o 。A r
7、 g ， 其E C 5 0 值分别为：4 9 1 9 M 和5 3 9 1 x M 。 关键词：大米蛋白，抗氧化肽，超声，酶解，制备技术，性能 A B S T R A C T A B S T R A C T T h ep r e p a r a t i o nt e c h n o l o g yo fa n t i o x i d a n tp e p t i d e s ，w h i c hd e m e df r o m h y d r o l y s i so fr i c ep r o t e i nb ye n z y m e ，a n dt h ep e p t i d e s
8、s c h a r a c t e r i s t i c sw e r e i n v e s t i g a t e di nt h i ss t u d y T h r e ec o m m e r c i a lp r o t e a s e s ，f l a v o r , n e u t r a l ，a n dp a p a i n ，w e r es e l e c t e df r o m s e v e no n e s a c c o r d i n g t ot h ee l i m i n a t i o nr a t e so f1 , 1 D i p h e n
9、y l - 2 - p i c r y l h y d r a z y l p P P I - I ) f r e er a d i c a lo fh y d r o l y t e s O r t h o g o n a lt e s t sw e r ep e r f o r m e dt od e t e r m i nt h e r e s p e c t i v eo p t i m u mh y d r o l y s i sc o n d i t i o no fe a c hp r o t e a s e A n dt h ee l i m i n a t i o nr a
10、t eo f D P P Hf r e er a d i c a lo fe a c ho p t i m u mh y d r o l y z e ds o l u t i o nw e r e7 5 2 ，8 9 5 a n d 5 8 8 ，r e s p e c t i v e l y T h ev a l u e so fE C 5 0o ft h ea n t i o x i d a n tp e p t i d ep r o d u c t sw e r e 2 9 2m g m L ，2 1 7m e m E , a n d3 8 6m e m E , r e s p e c
11、t i v e l y T h en e u t r a lp r o t e a s eW a S p r e f e r r e d b e c a u s et h e h y d r o l a t eb yt h e n e u t r a l p r o t e a s e s h o w e dt h e h i g h e s t a n t i o x i d a n t a c t i v i t yi nt h et h r e eo n e s A n dt h eo p t i m a le n z y m a t i ch y d r o l y s i s t e
12、 c h n o l o g i cp a r a m e t e r sw e r ea sf o l l o w i n g s ：t h ec o n c e n t r a t i o no fs u b s t r a t el O g l O O m l ， t h eq u a n t i t yo fp r o t e a s e8 ，p H6 0a t6 0 “ Cf o r3 0m i n T h ec o m b i n a t i o n so ft w oe n z y m a t i ch y d r o l y s i sw e r et e s t e db a
13、 s e do ns i n g l e e n z y m a t i ch y d r o l y s i sf o rr i c ep r o t e i n I tw a sf o u n dt h a tt h ea d d i n go r d e ro fe n z y m e s a f f e c t e dt h ea n t i - o x i d a n ta c t i v i t yo fh y d r o l y t e o b v i o u s l y I ti sa d v a n t a g e o u st o d e - a c t i v et h
14、ee n z y m ea f t e rt h ef i r s te n z y m a t i ch y d r o l y s i s F o re n z y m a t i ch y d r o l y s i so f r i c ep r o t e i n ，t h eo p t i m a lc o m b i n a t i o nw a s * f i r s t l yn e u t r a lp r o t e a s eh y d r o l y s i sf o r3 0 m i n ，t h e np a p a i nh y d r o l y s i sf
15、 o r1 5 m i na f t e rd e a c t i v en e u t r a lp r o t e a s e T h eE C 5 0o f h y d r o l y s a t e s o l u t i o nw a s 1 2 3 m g m L , d e c r e a s e d4 3 3 c o m p a r e dw i t hs i n g l e e n z y m a t i ch y d r o l y s i s T h er a Wm a t e r i a lo fr i c ep r o t e i nW a sp r e t r e
16、a t e db yu l t r a s o u n d ( p o w e r1 5 0 0 W , a t i n i t i a l t e m p e r a t u r e4 0 “ Cf o r2 0 m i n ) ，t h e nh y d r o l y z e dw i t hn e u w a lp r o t e a s e T h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ee l i m i n a t i o nr a t eo fD P P Ha n dE C 5 0w e r e7 4 8 a n d0 9 3 2 m 江苏大学博士学位论文：大米蛋白酶法制备抗氧化肽的研究 m m L , r e s p e c t i v e l y T h eE C s od r o p p e d5 7
