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1、细胞培养技术1.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种? 按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型?试述上皮型细胞的起源及主要形态学特征；成纤维型细胞的起源及主要形态学特征。【解答】：按生长方式分为二型： 粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。 （绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。）按照培养细胞的主要形态，可分为以下类型：(1)上皮型细胞 (2)成纤维型细胞(3)游走型细胞 (4)多形型细胞上皮型细胞来源：来源于外胚层，内胚层细胞（个别例外） 如：皮肤及其衍生物消化道，乳腺，肺泡，上皮性肿瘤形态：类似体内的
2、上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核 生长特点：易相连成片；相靠紧密相连成薄层铺路石状；生长时呈膜状移动， 很少脱离细胞群而单个活动。成纤维型细胞：来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出23个长短不等的突起 中有卵圆形核生长特点： 排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细胞细胞接触易断开而单独行动； 游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起。2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程【解答】： 通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶
3、段：原代培养期原代培养也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。传代期 传代期通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系（cell line）。一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。衰退期处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后
4、衰退死亡。上文所述特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性（immortality）或恶型性（malignancy）的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系（infinite cell line），或连续细胞系（continuous cell line）。每代贴附生长细胞的生长过程：游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 时间：10分钟一4小时贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。 底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6
5、24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂n 机制：接触抑制、密度限制3.简述体外培养细胞对生存环境的基本要求.【解答】： 细胞的营养需要：基本营养物质：氨基酸（种谷氨酰胺）维生素葡萄糖、核糖、脱氧核糖等无机离子等促细胞生长因子：多由血清提供细胞的生存环境：温度条件对细胞生长的影响：不同生物来源的组织细胞培养温度不同；体外培养动物细胞最常用的温度是37。耐低温不耐高温！在生理温度范围内，温度与细胞生长率之间存在正相关关系。（复习：温度对酶促反应的影响） 气相环境对细胞生长的影响：动物细胞培养的气相环境都
6、是采用5%CO2与95%空气（提供氧）的混合气体。2参与细胞的能量代谢过程。2用于维持培养液的酸碱度。一般多为开放式培养 培养液的酸碱度对细胞生长的影响：大多数的有机体细胞能在pH6.08.0的环境中生存。最适宜的pH值范围是7.27.4。体外培养的正常细胞耐酸能力要强于耐碱能力无污染、无毒（前提条件！）4什么是细胞培养用液,主要分为哪几类?【解答】： 培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。主要包括：平衡盐溶液 ； 培养基； 其他培养用液 。5D-Hanks与Hanks的主要区别是什么?【解答】： D-Hanks不含有Ca2+、Mg2+ ，常用于配制胰酶溶
7、液。6简述胰酶的常用浓度及配制时的注意事项。【解答】：胰酶(trypsin)溶液： 浓度一般为0.10.25 配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液 。7.细胞培养中血清的主要作用？【解答】：(1)提供基本营养物质 ； (2)提供贴壁和扩展因子 (3)提供激素及各种生长因子； (4)提供结合蛋白 (5)对培养中的细胞提供某些保护作用 8.血清的使用与储存有哪些注意事项？【解答】：(1) 使用前的处理：血清在使用前通常在56加热30分钟，这一过程称为灭活。热灭活目的：灭活血清中的补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。储存条件： 血清一般储存于
8、20,同时应避免反复冻融 。大包装的血清，首先将血清灭活处理，然后分装为小包装，如10ml、20ml、50ml，储存于-20，使用前融化。融化后的血清在4不宜长时间存放，应尽快使用。9.简述干粉培养基的配制过程。【解答】：DMEM培养液的配制（举例）：900 mL ddH2O于1000 mL烧杯中，将DMEM粉1包倒入其中，盛粉袋用50 mL ddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）搅拌溶解。用510的NaHCO3调pH至7.2加青、链霉素至终浓度100u/mL 和100ug/mL 用0.22um的滤膜过滤除菌。分装（200 mL左右）后4冰箱保存。 10.细胞培养工作室可分为那几个部分
9、，各有什么作用?【解答】：一般包括：准备室、培养室和缓冲室准备室：用于进行培养器皿的清洗、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等。培养室：用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。天花板不宜高过2.5M。缓冲室：（更衣室）11. CO2培养箱的作用及使用中的注意事项。【解答】：用于维持适当温度、湿度与pH质量关键在控温装置，温度变化一般不应超过0.5度;培养箱的温度设在3537，这是人和哺乳动物培养细胞的最适温度。 培养容器需与外界保持通气状态箱内空气应保持干净，定期消毒（紫外灯、酒精）水槽:保持一定湿度12. 试述清洁液的配方组
10、成及配制时的注意事项。【解答】：清洁液 :重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）强清洁液 631000200 次强清洗液 120 2001000 弱清洁液 100 1001000配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸，并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色13简述消毒灭菌的常用方法、要求条件及主要应用范围。【解答】：物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿。 消毒时间：30min（至少） 紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还可以由
11、产生的臭氧来完成。紫外灭菌以后，最好过一个小时再进去。过滤：0.22m（适用于液体）湿热（高压蒸气灭菌法）15磅,121，20min各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下： 培养用液、橡胶制品 l0磅l0分钟 布类、玻璃制品、金属器械等 15磅20分钟干烤：160, 2 小时（适用于玻璃器皿等）注意：消毒后不要立即打开箱门，以防止冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。化学消毒灭菌法7%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。1新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。在细胞培养中最常用的抗生素是青霉素（常用浓
12、度是100u/ml）与链霉素（100g/ml）。建议不要在原代培养中加入抗生素 。14. 如何对玻璃器皿进行有效清洗？【解答】：玻璃器皿的清洗：浸泡刷洗(+烘干)浸酸冲洗清洗后的玻璃器皿：干净透明无油迹。浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。先用自来水简单刷洗，然后用5稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的残留蛋白质，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。刷
13、洗：用毛刷（特制的羊毛刷）沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。自然晾干或烘干后泡酸。浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液（洗液）中。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时。冲洗在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗,使之尽量不留污染或清洁液的残迹。最好用洗涤装置。如用手工操作，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，然后用蒸馏水清洗3-5 次，晾干（或烘干）备用15细胞培养中最常用的抗生素及使用浓度是什么?【解答】：青霉素（常用浓度是1
14、00u/ml）与链霉素（100g/ml）。16什么是原代培养？简述原代培养方法的分类及主要操作步骤。【解答】：原代培养取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。原代培养方法分类：贴块法和消化法。消化法又分为冷消化与热消化；一次性消化与分次消化。主要步骤：贴块法：将取得洗净并剔去多余成分的组织切成约1mm3大小的植块，用于植块培养。消化法：将取得洗净并剔去多余成分的组织剪碎蛋白酶溶液消化机械方吹打组织块对滤过液离心（1000r/min, 10min）用培养液悬浮成细胞悬液计数并调节细胞密度用于分离细胞培养17何谓传代培养？简述贴壁细胞的传代操作步骤。【解答】：传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁细胞传代培养：选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入23ml的D- Han
