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1、1.4 催化与生物催化 固定化乳酸菌细胞催化合成-氨基丁酸的研究 固定化乳酸菌细胞催化合成-氨基丁酸的研究 武鸿 黄俊 梅乐和 姚善泾 （浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江杭州 310027） 摘摘 要要 利用从未经消毒的新鲜牛奶中分离筛选，并经过紫外线和 60Co 辐射诱变而获得的短乳酸杆菌固定化催化谷 氨酸脱羧合成有重要生理活性的-氨基丁酸。考察固定化条件、底物谷氨酸钠和产物 GABA 的浓度、辅助底物葡萄 糖的浓度以及 pH 和温度、 操作稳定性等因素对反应初速度和 GABA 产率的影响， 并对固定床反应器催化合成 GABA 的过程进行研究。实验表明细胞固定化后温度稳定性大大提高，操作
2、稳定性良好。在间歇式反应器优化的条件下， 采用固定床反应器，可有效减轻产物抑制，提高底物转化率和催化生产效率。 关键词关键词 GABA，-氨基丁酸，谷氨酸脱羧酶，细胞固定化，固定床 BIOTRANSFORMATION OF GLUTAMIC ACID INTO -AMINOBUTYRIC ACIDBY IMMOBILIZED LACTOBACILLUS WU Hong, HUANG Jun, MEI Lehe, YAO Shanjing (Dept of Chemical and Biochemical Engineering, Zhejaing University, Hangzhou 31
3、0027) Abstract The decarboxylation of glutamic acid salt to -aminobutyric acid was investigated with lactobacillus cell having higher glutamate decarboxylase. The lactic acid bacteria isolated from fresh milk without pasteurizzation was mutagenized by ultraviolet treatment and 60Co radiation. The de
4、carboxylation reaction was conducted in sodium acetate buffer, and L-MSG and GABA concentration was determined by HPLC. The effects of substrate and product concentration, concentration of co-substrates glucose, pH of the buffer, reaction temperature and the repeated use of cell on the initial react
5、ion rate and maximum yield were studied. The optimal pH and glucose concentration were 4.4 and 1g/L. The thermal stability of immobilized cells was significantly enhanced than free cells. Under the optimum conditions in batch reactor, reaction was carried out in the packed-bed reactor, which could i
6、ncrease the conversion of substrate and catalyzation efficiency. Keywords GABA, -aminobutyric acid, glutamate decarboxylase 引 言 引 言 -氨基丁酸（简称 GABA） ，又称氨酪酸，作为中枢神经系统重要的神经递质1,2，具有重要的 生理功能，是一种重要的非蛋白质氨基酸。已有研究表明，GABA 能降血压和胆固醇、增强脑功能 和长期记忆、增加生长激素分泌、防止肥胖、健肝利肾、改善更年期综合症等功能3,4。 虽然 GABA 广泛存在于生物体内， 但含量都很低， 分离非常困难，
7、 主要依赖于合成方法来制备。 GABA 合成方法主要有化学合成法和生物合成方法。其中，生物合成 GABA 是利用生物体内的谷氨 酸脱羧酶作为催化剂，以 L-谷氨酸钠（L-MSG）为底物，将 L-谷氨酸钠-脱羧而生成-氨基丁酸。 与化学合成方法相比，生物法催化合成 GABA 具有原料来源丰富、合成条件温和、能耗低、环境污 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
8、 通讯联系人通讯联系人：梅乐和，E-mail:meilh ；第一作者第一作者:武鸿，女，1983 年出生，学士，硕士研究生。基金项 目 基金项 目:教育部留学回国人员基金、浙江省科技攻关项目、浙江省留学回国人员基金 染小等优点。有关 GABA 的生物合成的研究已有报道，但这类研究主要集中在利用大肠杆菌中谷氨 酸脱羧酶发酵生产 GABA。随着绿色食品的不断开发，一些含有谷氨酸脱羧酶的曲霉、酵母菌、乳 酸菌等逐渐代替大肠杆菌，用于催化谷氨酸脱羧制得 GABA。乳酸菌作为一种益生菌，其健康功效 为世人所公认，被美国 FDA 认为是“GRAS”级食品添加剂。乳酸菌除生产乳酸外，还能生成一些有 益健康的
9、生理活性物质，如乳酸菌素、-氨基丁酸5,6等。迄今，国内尚未见固定化乳酸菌细胞催化 谷氨酸脱羧制备-氨基丁酸的报道。 本研究拟以自行筛选并经过诱变获得的高产 GABA 乳酸杆菌为催化剂，利用海藻酸钙固定化乳 酸菌催化 L-谷氨酸钠的脱羧反应制备 GABA，将对影响催化合成的诸多因素进行考察和优化，并对 不同的操作方式进行比较。 1 材料和方法 1 材料和方法 1.1 材料材料 菌株：采用本实验室筛选并经过紫外线和 60Co 辐射诱变获得的高产 GABA 菌株 hjxj-08119，已在 中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，编号为 CGMCC NO.1306。试剂：标准 GABA 购自 ACROS
10、 ORGANICS 公司；丹磺酰氯购自 Flukachemie 公司；谷氨酸钠(L-MSG)购自国药集团化学试剂公司； 酵母提取物购自上海生工；其它试剂为国产分析纯。 1.2 乳酸菌细胞的培养和收集乳酸菌细胞的培养和收集 斜面保藏培养基的组成为葡萄糖 10g/L，酵母膏 10g/L，蛋白胨 5g/L，乙酸钠 2g/L，MgSO47H2O 20mg/L，MnSO44H2O 1mg/L，NaCl 1mg/L，FeSO47H2O 1mg/l，琼脂 15g/L，pH 6.8。种子培养基 的组成同保藏培养基，但无琼脂。发酵培养基的组成同种子培养基，但加入了 10g/L-谷氨酸钠 （L-MSG） 。菌株经
11、琼脂斜面培养基活化后，转接于种子培养基培养 24 小时后，以 1的接种量接 种于发酵培养基，30恒温静置培养 60h，8000rpm 离心收集菌体，置于 4冷藏备用。 1.3 分析方法建立分析方法建立 仪器：Agilent 1100 高效液相色谱，紫外检测器，色谱柱：ODS Hypersil，Dim(mm)2504.6 流动相：A：甲醇；B：四氢呋喃-甲醇-0.05mol/L 醋酸钠(pH 6.2)(5:75:420,V/V)，经超声脱气；样品 处理以及操作条件参考文献7。 1.4 固定化乳酸菌细胞的制备固定化乳酸菌细胞的制备 通过正交实验，综合考虑机械强度、催化效率和传质性能多种因素，得到适
12、宜的胶囊制备条件 为海藻酸钠（SA）浓度 15g/L，CaCl2溶液浓度为 20g/L，反应和放置时间为 30min，菌体包埋量为 1g/100ml SA。 2 结果和讨论 2 结果和讨论 2.1 间歇式反应器催化考察间歇式反应器催化考察 2.1.1 pH 对固定化催化的影响对固定化催化的影响 在固定化细胞催化中，选用乙酸乙酸钠缓冲体系。实验中底物浓度选择 40mmol/L，35下摇 床催化，游离细胞催化对比。结果如图 1 所示。用固定化细胞催化 1h 的结果表征反应初速度，用生 成 GABA 的峰面积与相同条件下游离细胞所得峰面积相比得到的相对值表示，用 7.5h 后 GABA 的 产率来表
13、征反应最终产率。pH 值对催化活性和 GABA 产率都有很大影响，最适 pH 为 4.4。 3.64.04.44.8 40 50 60 70 80 90 100 10 20 30 40 50 60 70 Relative activity pH Y/% 020406080 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 Initial rate of GABA production(mmol/(g .h) Concentration of L-MSG(mmol/L) 图 1 pH 对固定化催化的影响 图 2 底物浓度对反应初速度的影响 2.1.3 底物浓度对固定化催化的影响底物
14、浓度对固定化催化的影响 在固定化体系中，底物浓度的增加对催化结果可产生两方面的影响，一方面，提高底物浓度可 以扩大胶珠内外传质动力，有利于底物向固定化体系内扩散，有利于底物的转化；另一方面，提高 底物浓度后，产物浓度也将随之升高，由于存在产物抑制作用，对催化反应产生不利影响。取不同 底物浓度下催化 1h 的样品进行 HPLC 分析，结果如图 2 所示。底物浓度超过 60mmol/L，反应速度 不再增加，适宜的底物浓度选在 60mmol/L。 304050607080 0 20 40 60 80 100 Relative activity(%) T(oC) cells with immobili
15、zation cells without immobilization 123456789101112 0 20 40 60 80 100 Y,% Batch 图 3 温度对催化反应影响 图 4 操作稳定性 2.1.4 固定化催化温度稳定性考察固定化催化温度稳定性考察 将乳酸菌在 30、40、50、60、70、80下放置 30min 后，再进行谷氨酸钠脱羧反应，分别以未 经高温处理的细胞催化的相对活性对温度作图，如图 3 所示。由图可知：固定化细胞的催化活性相 对下降较慢。温度越高，固定化细胞的稳定性与游离细胞相比越好，说明细胞固定化后温度稳定性 大大提高。 2.1.5 固定化催化操作稳定性考
16、察固定化催化操作稳定性考察 在 35下连续催化浓度为 30mmol/L 的底物，以 GABA 产率对操作批次作图，见图 4。连续操 作 9 批后产率仍可达到 75%以上，可见固定化操作稳定性较高。 2.2 固定床反应器催化考察固定床反应器催化考察 2.2.1 底物浓度对转化率的影响底物浓度对转化率的影响 在固定床反应器中填满海藻酸钙胶珠，分别取底物浓度为 30、60mmol/L，调节底物流速，待流 出液体积为床层体积 2 倍时认为达到反应达平衡，可取样分析。同时用相同浓度底物在间歇式反应 器中对比，两种反应器中的催化结果见下。 由图 5 可以看出，底物浓度较低时，固定床反应器和间歇式反应器的转化效率相差不是很大， 但底物浓度较高时，图 6 所示，间歇式反应器催化效果大大低于固定床反应器，固定床反应器的优 势体现的非常明显，底物最终转化率可达 90%以上。从图 5、6 中固定床催化结
