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1、河南农业大学 硕士学位论文 固始鸡安卡鸡F代资源群Myf5基因多态性研究 姓名：马新红 申请学位级别：硕士 专业：动物营养与饲料科学 指导教师：王清义;康相涛 20100601 河南农业大学2 0 1 0 届硕十研究生学位论文 中文摘要 本研究以我国优质地方蛋肉兼用品种固始鸡和快大型肉鸡安卡鸡为素材，采用 P C R S S C P 、D N A 钡U 序、C R S P C R - R F L P 等技术，对F 2 代群体中生肌因子5 ( M y f 5 ) 基因的遗传多 态性进行了研究，并通过最小二乘分析评价了该基因变异位点与主要经济性状的关联性。主 要结果如下： ( 1 ) 本研究在鸡的
2、生肌因子5 的外显子1 上引入M s p l 酶切位点，M s p I 酶切位点为C C G G ，相 对原序列C c G A 突变了一个碱基，在P C R 产物中包含这个酶切位点。经测序和序列比对表明，该 位点T 1 8 8 C ( N C _ 0 0 6 0 8 8 ) 是同义突变，没有引起氨基酸序列的变化。在该群体中A B 基因型居 多，从、B B 基因型的检出率相对比较低，等位基因A 为优势基因， A B 基因型为优势基因型。 P I C 为0 3 7 5 ，属中度多态，经x2 适合性检验，该位点在该群体极显著的偏离了H a r d y w e i n b e r g 平衡( P O
3、5 时，该位点 为高度多态位点：当0 5 P I C O 2 5 时，该位点为中度多态位点，当P I C A _ A 。说明M y f 5 基 因与鸡的生长发育有关，尤其是与鸡早期的体重变化相关，但是否能将M y f 5 基冈作为鸡的生 长性状的候选基冈还有待进一步的研究。 M y o D 基因家族控制着整个肌肉的发育过程，从前体肌细胞的增值、分化到肌纤维的形 成，直到个体出生后的成熟和功能的完善，都有生肌调节因子的参与。孙文浩( 2 0 0 8 ) 在研究 鸡M y f 5 基因时，发现了两个s n p 位点，结果显示该基冈各单倍型组合型对活体重、屠体重、 胸肌重和腿肌重等屠体指标都有显著性
4、影响，与肌纤维密度和肌纤维直径两嫩度指标也显著 相关。S o u m i t l i o n ( 1 9 9 7 ) 等在研究猪的M g o G 基冈座位的变异时，发现它影响肌纤维数，与 出生重和屠体重相关。本实验对突变产生的基因型和部分肉质性状、屠体性状、肌纤维特性、 部分血液生化指标进行最小二乘均数差异显著性检验。结果表明：此突变位点对肉质性状、 屠体性状、肌纤维特性、部分血液生化指标的影响均没有达到显著水平。这一结果与上述有 关人的报道结果差异较大，是否与突变位点在M y f 5 基因上的位置有关，还需做进一步的研 究。 3 1 河南农业大学2 0 1 0 届硕七研究生学位论文 第四章M
5、 y f 5 基因P C R - S S C P 多态性与经济性状的相关性分析 4 1 材料与方法 4 1 1 药品 丙烯酰胺A R ：A B l 分装。 双丙烯酰胺：A B l 分装。 T E M E D ：A B l 分装。 甲醛A R ：北京化工厂。 硝酸银A R ：北京化工厂。 无水乙醇( E t h a n 0 1 ) A R ：北京化工厂。 D N AM a r k e r h 郑州科锐华生物技术有限公司。 4 1 2 引物的设计与合成 利用p r i m e r 5 分析软件，根据鸡基因组序列中M y f 5 基因( G e n B a n k 登录号：N C _ 0 0 6 0
6、 8 8 和X 7 3 2 5 0 ) 序列和M y f 5 基因的m R N A 序列( G e n B a n k 登录号：N M _ 0 0 1 0 3 0 3 6 3 ) 对鸡 J y f 5 基因的编码区序列( 第一外显子) 设计引物。 表4 - 1 鸡M y f 5 基因的引物序列 T a b 4 - IN u c l e o t i d es e q u e n c e so f p r i m e r st oc h i c k e nM y f 5g e n e 4 1 3 分析软件 1 引物设计：p r i m e r 5 2 突变位点检测：D N A M A N ( 6
7、0 版) 3 同源序列比较：B L A S T 4 统计分析：S P S S1 3 0 软件包 4 2 主要步骤 4 2 1 缓冲液与常用试剂配制 3 0 丙烯酰胺贮存液：2 9 9 丙烯酰胺，l gN ，N 一亚甲双丙烯酰胺，溶于6 0 m l 的水中，3 7 。C 助 溶，然后加水至1 0 0 m l ，棕色瓶4 保存 1 0 过硫酸铵：把1 9 过硫酸铵溶解于l O m l 水中，4 保存( 最好新鲜配制) 。 7 0 乙醇：7 0 0 m l 无水乙醇中加入3 0 0 m l 双蒸水。 固定液：无水乙醇2 0 m l ，冰醋酸I m l ，加水至2 0 0 m l 染色液：0 4 9A
8、 g N O 。用水溶解后，无水乙醇2 0 m l ，水1 8 0 m l ，冰醋酸l m l ，加水至2 0 0 m l 氢氧化钠显色液：6 9 N a O H ，1m l 甲醛，加水至2 0 0 m l S S C P 上样缓冲液配比：去离子甲酰胺9 8 m l 河南农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 2 甘油2 0 0 u l 0 5 m o l LE D T A ( p H 8 0 ) 2 0 0 u l 0 0 2 5 溴酚兰1 0 0u l 0 0 2 5 - - - 甲苯氰1 0 0u l 4 2 2P C R S S C P 过程 4 2 2 1P C R 反应条件
9、( 1 ) 本实验P C R 反应体系如下： 1 0 XP C R 缓冲液2 5uL T a qD N A 聚合酶( 0 5U uL ) 0 3uL d N T P s ( 1 0m o l m L ) 0 5 I lL 弓I 物( 1 0p m o l L ) 各0 5 uL D N A 模板( 1 0 0n g l IL ) 1 1 1L 灭菌超纯水1 9 7uL 总体积2 5uL ( 2 ) P C R 反应的程序 9 5 预变性5m i n 9 4 变性3 0S L 6 3 “ C 退火3 5SI 3 4 7 2 延伸3 0S 7 2 延伸1 0a i n 4 保存 4 2 2 210
10、 9 l 非变性聚丙烯酰胺凝胶( 3 0 r a l 体积) 制作及电泳 ( 1 ) 清洗制胶用的玻璃板、胶条，烘干后，用封条封闭玻璃板和胶条间的缝隙。 。 ( 2 ) 3 0 m 11 0 的丙烯酰胺胶工作液的配制：3 0 9 6 丙烯酰胺l O m l ，5 0 甘油3 m l ，1 0 T B E 3 m l ，1 0 过硫酸铵2 0 0I I1 ，T E M E D 2 0u1 ，加入纯水1 4 a l ，混匀后迅速灌胶。 ( 3 ) 当浇灌至离玻璃板上沿0 1 c m 时停止灌胶，插入梳子，室温聚合，多余的丙烯酰胺4 “ C 下保存，并随时观察凝胶聚合情况。 ( 4 ) 等凝胶聚合好
11、后，向电泳槽中加入1X T B E ，用注射器冲洗加样孔。预电泳l O m i n ，同时 准备点样。 ( 5 ) 取3 l llP E R 产物置于P C R 管中，加1 0 ul 变性B u f f e r ，9 8 变性l O m i n 。 ( 6 ) 迅速置于冰上，冰浴l O m i n ，用l Ou1 的加样枪点样。 ( 7 ) 打开电源，1 2 0 V ，电泳1 6 h 。 4 2 2 3 硝酸银染色 ( 1 ) 固定：电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取出凝胶置于7 0 乙醇溶液中，水 河南农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 浴震荡器上缓慢摇匀固定1 0 1 5
12、m i n ( 乙醇用完可以回收) ，去离子水洗胶3 次，每次2 m i n ， 洗去乙醇。 ( 2 ) 染色：用2 0 0 m l 染色液染色3 0 m i n ，去离子水漂洗凝胶3 遍，每次2 m i n ，洗去多余的 染色液。 ( 3 ) 显色：加入2 0 0 m l 显色液显色约1 0 3 0 m i n ，当D N A 带的强度合适时，倒掉显色液，去 离子水洗掉多余的显色液，扫描照相，并用自封袋密封保存。 4 3 结果与分析 4 3 。1P C R 扩增结果 用设计的引物对鸡的基因组D N A 进行P C R 扩增，扩增产物经琼脂糖电泳检测后见图4 - 2 ， 结果表明，提取的基因组
13、D N A 经P C R 扩增，琼脂糖检测可见一条清晰、致密的条带，与D N A 分 子量标准相比，与预期片段大d , 3 0 2 b p 相符合，可用于s s c p 分析。 图4 2 引物2 扩增产物 F i 9 4 2P C Rp r o d u c to f p r i m e rp a i r2 4 3 2P O R - s s c p 结果 在1 0 的非变性聚丙烯酰胺凝胶的电泳条件下，对资源群体的P C R 产物进行s s c p 分 析，结果该位点共检测到三种基因型，分别为c C 、C D 和D D 。取各基因型的P C R 产物直接进 行测序。共检测到两个变异位点即A 5 3
14、 3 G 和T 6 3 2 C ( N C _ 0 0 6 0 8 8 ) ，由氨基酸比对结果可知， 该两位点突变为谷氨酸和天冬氨酸的同义突变。 C CC DD DC CC DC DD D 一- _ 奠一- 韬 图4 - 3 引物2 的S s c P 电泳图 F i g 4 - 3T h eS S C Pe l c c t r o p h o r c s i so f P r i m e r2 河南农业大学2 0 1 0 届硕+ 研究生学位论文 C C 型基因 GGT c 土；o cG - Gcc ，是o c GG Gct 孑昱o G - GTG TG 2 是0 T D D 型基因 1 5 0
15、 G G TAc 丁CG _ 1 6 0 GCCTCC GG C D 型基因 1 5 01 6 0 GGT A C A TCG - AGCCTCC GG 2 5 0 2 6 0 GCT C CGA GTG tGGT 2 5 02 6 C GCT CcG I IGTG TGGTA 图4 - 3 测序结果 F i g4 - 3S e q u e n c ea n a l y s i s 河南农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 4 3 3M y f 5 基因P 2 位点在F 2 代资源群中的遗传特性 由表4 2 可知，C 等位基因为优势基因， C D 基因型为优势基因型。 表4 - 2 咐
16、f 5 基因在F 2 代资源群中基因型频率和等位基因频率 T a b 4 2O e n o t y p ea n dg e n e t i cf r e q u e n c yo fc h i c k e nM y f lg e n el o c u si nF 2p o p u l a t i o n 根据N e i 的方法，群体遗传指标( 基因纯合型、杂合型、有效等位基因以及多态信息含 量等) 被计算( 表4 - 3 ) 。其中多态信息含量为0 3 7 3 ，属中度多态( 0 2 5 I ) D 基因 型，但该基因位点的突变是否能使高密度脂蛋白驱动胆固醇逆转运还需进步的研究确定。 血清肌酸磷酸激酶( C K ) 是一种广泛存在于骨骼肌和心肌等肌肉组织中的酶，它可催化可 逆反应肌酸与磷酸肌酸的转化。通过血清肌酸磷酸激
