《固化的金属离子亲和层析和质谱联用鉴定磷酸化多肽的策略优化和快速老化小鼠脾淋巴细胞衰老相关的蛋白质组研究(1)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《固化的金属离子亲和层析和质谱联用鉴定磷酸化多肽的策略优化和快速老化小鼠脾淋巴细胞衰老相关的蛋白质组研究(1)（99页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、北京协和医学院;中国医学科学院 博士学位论文 固化的金属离子亲和层析和质谱联用鉴定磷酸化多肽的策略优 化和快速老化小鼠脾淋巴细胞衰老相关的蛋白质组研究 姓名：李耀军 申请学位级别：博士 专业：生物化学与分子生物学 指导教师：郑德先;刘彦信 20080501 北京协和医学院博士学位论文 中文摘要 一、固化的金属离子亲和层析和质谱联用鉴定磷酸化多肽的策略优化 可逆磷酸化是一种重要的细胞信号传导模式，也是调节蛋白质表达和功能的核心 机制，因而参与调节了绝大多数的细胞生命活动。由于磷酸化蛋白质的相对低丰度、 负电性和相对的亲水性，所以磷酸化蛋白质或多肽的富集和提高质谱仪的灵敏度就显 得十分重要。近年来
2、，作为一种快速、简单易用和经济的策略，固化的金属离子亲和 层析技术( I M A C ) 被研究者广泛地应用于磷酸化多肽的富集。应用该方法时，研究 者们把主要注意力放在如何降低那些含有酸性侧链氨基酸( 如谷氨酸和天门冬氨酸) 的非磷酸化多肽对富集磷酸化多肽的影响上。然而，混在蛋白样品中的核酸对于 I M A C 富集磷酸化多肽的影响却未见报道。目前主要有两种I M A C 策略被应用，一种 需要甲酯化处理样品的I M A C ( M E I M A C ) 策略和另一种不需要甲酯化处理样品的 I M A C ( N o n - M E I M A C ) 策略。本项研究首先通过对两种I M A
3、 C 策略的比较实验， 证明M E I M A C 策略容易造成样品丢失和增加质谱分析的复杂度，而N o n M E I M A C 策略才是更为简单有效的磷酸化多肽富集策略。接着，我们对N o n - M E I M A C 策略进 行了较为细致的优化。发现理想的N o n M E I M A C 上样洗涤溶液是8 A C N 0 3 T F A ，最理想的洗脱液是0 2m o l L 磷酸氢铵( p H 8 0 ) 。另外，更为重要的 是，我们发现在强酸性条件( p H 7 0 ) o n 3 北京协和医学院博士学位论文 p h o s p h o p e p t i d e se n r
4、 i c h m e n tb YI M A C I nt h i ss t u d y , w ef o u n das i m p l ea n de f f i c i e n t m e t h o d - A C Np r e c i p i t a t i o n t or e m o v en u c l e i ca c i d st or e d u c et h ea d v e r s ee f f e c t sa n dt h e e n r i c h m e n tr a t i oc o u l di n c r e a s em o r et h a na b
5、 o u t2 0 0 T h i ss t u d yw i l lb eag o o dr e f e r e n c e t om o r ea n dm o r er e s e a r c h e r si np h o s p h o p r o t e o m i c s 2 T h e a g i n g r e l a t e dp r o t e o m ea n a l y s i so fs p l e n i cl y m p h o c y t e si n s e n e s c e n c e , - a c c e l e r a t e dm o u s e
6、 A g i n gi sa s s o c i a t e dw i t ha 、析d eo fs p e c t r u mo fd e g e n e r a t i v ed i s e a s e s ，i n c l u d i n g A l z h i m e r Sd i s e a s e ，P a r k i n s o n Sd i s e a s ea n dd i s o r d e ro fi m m u n o l o g i c a lf u n c t i o n s S e n e s c e n c e a c c e l e r a t e dm i
7、c eb e l o n gt oi n b r e ds t r a i nm o u s e ，a n dm a n ya g e r e l a t e d f u n c t i o n a ld i s o r d e r sa p p e a rw i t ht h e i ri n c r e a s i n ga g e B e s i d e s ，m a n yp a t h o b i o l o g i c a l p h e n o t y p e so fs e n e s c e n c e - a c c e l e r a t e dm i c e a r e
8、s i m i l a rw i t ha g i n gh u m a n I no r d e rt o d e t e c td i f f e r e n t i a lp r o t e o m et h a tm a yi n v o l v e di na g i n go ra g i n g - r e l a t e dd i s e a s e sb e t w e e n S A M P 8a n dS A M R l ，t h es p l e n i cp r o t e o m e sf r o m9 - m o n t h - o l dS A M P 8a n
9、 dS A M R lw e r e p r e p a r e d a n d s e p a r a t e db y t w o d i m e n s i o n a l p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( 2 D P A G E ) A sar e s u l t ，t w e n t yo n ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i ns p o t s 、e r ed e t e c t e d T h ea g e
10、 dS A M P 8m i c es h o w e da l a r g ei n c r e a s eo fo v e r2 - f o l di nt h ee x p r e s s i o no ft h i r t e e n s p o t s ，a n dt h ee x p r e s s i o no fe i g h ts p o t sw a se l e v a t e do v e r2 - f o l di nS A M R lc o m p a r e dt o S A M P 8 ，n l ed i f f e r e n t i a ls p o t s
11、w e r es u b m i t t e dt op e p t i d em a s sf i n g e r p r i n t ( P M F ) a n a l y s i s b yM A L D I T O F - M S ，a n dt h e nu s i n gt h es o R w a r eM A S C O T t os e a r c ht h ep r o t e i nd a t a b a s e o n l i n e Ap r o t e i nn a m e d “A n n e x i nI ”，w h i c hw a su p - r e g
12、u l a t e di nt h es p l e n i cl y m p h o c y t e s o fS A M P 8 ，W a sv a l i d a t e db yW e s t e mb l o t T h ef u n c t i o n a li m p l i c a t i o n so fo t h e r d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e dp r o t e i n si n v o l v e di na g i n go ra g i n g - r e l a t e dd i s e a s e
13、sw e r e d i s c u s s e d 4 A C N ：a c e t o n i t r i l e 英文缩略语 B S A ：b o v i n es e r u ma l b u m i n C H A P S ：3 - ( 3 C h l o a m i d o p r o - p y l ) d i m e t h y l a m m o n i o - l - p r o p a n e s u l f o n a t e C H C A ：a l p h a - c y a n o4 - h y d r o x y c i n n a m i ca c i d C
14、 T A B ：h e x a d e c y lt r i m e t h y la m m o n i u m b r o m i d e D T E ：d i t h i o - e r y t h r i t o l D T T ：d i t h i o t h r e i t o l D H B ：2 ，5 - d i h y d r o x y b e n z o i ca c i d E D T A ：e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d A C ：a c t i v a t e dc h a r c
15、o a l I D A ：i m i n o d i a c e t i ca c i d ； I E F ：i s o e l e c t r i cf o c u s i n g I M A C ：i m m o b i l i z e d m e t a l i o na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y I P G ：i m m o b i l i z e dp Hg r a d i e n t L B ：L u r i a - B e r t a n i L C ：l i q u i dc h r o m a t o g r a p h
16、 y M L U 。D I - 1 o F M S ：m a t r i x a s s i s t e dd e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m e - o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y M E ：m e t h y le s t e r i f i c a t i o n M H C ：m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x M S ：m a s ss p e c t r o m e t r y ； M S ，M S ：t a n d e mm a s ss p e c t r u m ； m z ：m a s sc h a r g er a t i o N O D ：n o n o b e s ep a t i e n t 、】l ，i n ld i a b e t e s
