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1、重庆医科大学 博士学位论文 喷射心肌打孔填充凝胶支架治疗犬心肌梗死 姓名：周大燕 申请学位级别：博士 专业：内科学（心血管病学） 指导教师：黄晶 20100501 重庆医科大学博士研究生学位论文 喷射心肌打孔填充凝胶支架治疗犬心肌梗死 摘要 背景和目的： 心肌打孔术( 刑R ) 即利用激光或者机械方式在心脏缺血区制 作多个与左心室腔相通的孔道，使心腔内血液注入到缺血心肌内，同 时通过血管新生可以营养该区域心肌，从而改善缺血心肌灌注。激光 心肌打孔术( T 池R ) 作为治疗顽固性心绞痛和晚期缺血性心脏病的 一种辅助治疗方法，可以改善心绞痛症状，提高运动耐量，改善心肌 灌注等，但是激光心肌孔道的
2、闭塞以及激光对周围心肌组织的热损伤 等限制了其应用。而针刺打孑L 和电钻打孔的心室壁孔道也同样面临心 肌孔道闭塞的问题。 针对上述血运重建方法的不足，本实验采用一种新型的心肌打孔 方式喷射心肌打孔( T M 瓜) 。该方法可以避免激光心肌打孔对心肌组 织带来的热损伤，以及避免针刺打孔和电钻打孔将直硬刚针插入搏动 的心脏，而且在喷射心肌打孔的同时可以喷入具有三维支架作用的凝 胶，凝胶在一定时间内可以对心肌孔道起到支撑作用，从而可能使心 肌孔道得以保留，而且可能使心肌孔道壁内皮化及血管化。本实验观 察了正常犬喷射心肌打孔填充不同凝胶支架后心肌孔道的演变规律， 以及不同凝胶支架的组织相容性；观察了在
3、急性心肌梗死犬模型的心 肌缺血梗死区行喷射心肌打孔填充凝胶支架，对心肌孔道的开放性、 3 重庆医科大学博士研究生学位论文 一t l , 肌血管新生、心室重构、以及血流动力学等影响。 方法： 1 、正常活体犬喷射不同凝胶心肌打孔 犬1 2 只，随机均分为3 组( n = 4 ) ：琼脂糖凝胶组( A H 组) ， 纤维蛋白凝胶组( F G 组) ，壳聚糖凝胶组( C H 组) 。 在各组用无针注射器分别喷射各种凝胶心肌打孔。3 组均于术 后2 、4 、6 周取含有孔道的心肌组织行H E 染色和M a s s o n 染色，观察 各种凝胶支架在一I i , 肌组织中的降解性和组织相容性；各组心肌孔
4、 道是否保留和开放；各组心肌孔道内及孔道周围的纤维组织增生情 况。 2 、心肌梗死犬喷射壳聚糖凝胶心肌打孔 3 2 只犬随机均分为4 组( n _ 8 ) ：单纯心肌梗死组( M I 组) 、 生理盐水组( N S 组) 、壳聚糖凝胶组( C H 组) 、壳聚糖凝胶+ 血管生 长因子组( C H + G F 组) 。 M I 组仅建立心肌梗死模型。N S 组，C H 组和C H + G F 组建立 心肌梗死模型后在心肌缺血梗死区用无针注射器进行喷射- t l , 肌打孔； N S 组心肌孔道内喷射生理盐水，C H 组喷射壳聚糖凝胶，C H + G F 组 喷射包载有生长因子( 血管内皮生长因子
5、联合碱性成纤维细胞生长因 子) 的壳聚糖凝胶。 术后6 周测量血流动力学参数；苏木素伊红( H E ) 染色 和免疫组化染色观察心肌孔道的开放性以及心肌孔道的内皮化情况； M a s s o n 染色观察心肌孔道内及孔道周围的胶原增生情况；免疫组 4 重庆医科大学博士研究生学位论文 化染色观察缺血心肌中血管性血友病因子( V W F ) 、0 t - 平滑肌肌动蛋 白( a S M A ) 的表达，计算微血管、小血管以及小动脉的密度；计 算心肌梗死面积、左右心室重量指数；计算心肌组织中I 、I I I 型胶 原容积分数及I I I IL t , 值。 结果： 1 、正常活体犬喷射不同凝胶心肌打
6、孔 琼脂糖凝胶的生物降解性和组织相容性差，引起周围组织大 量胶原增生，心肌孔道完全闭塞。 纤维蛋白凝胶具有良好的生物降解性和组织相容性，但支撑 度弱，其降解后心肌孔道基本闭塞。 壳聚糖凝胶具有良好的生物降解性、组织相容性及良好的支 撑度，其降解后可见心肌孔道开放及心肌孔道壁内皮化，心肌孔道内 及孔道周围少量纤维组织增生。 2 、心肌梗死犬喷射壳聚糖凝胶心肌打孔 术后6 周，H E 染色和免疫组化染色示：N S 组心肌孔道基 本闭塞，C H 组和C H + G F 组均可见孔道开放，而C H + G F 组孔道壁内 皮化更明显。 M a s s o n 染色示：N S 组心肌孔道内有大量的胶原纤
7、维填充， C H 组和C H + G F 组的心肌孔道有部分胶原纤维，尚有大量空腔存在。 和M I 组比较，N S 组、C H 组和C H + G F 组的小血管显著增 加( P 2 0u m ) 显著增多( P O 0 5 ) ：和N S 组比较， C H 组和C H + G F 组的小血管显著增多( P O 0 5 ) ，以C H + G F 组更显著( 见表2 ) 。 表2 各组小血管计数( 个高倍视野，石士s ) T a b l e 2R e s u l t so fs m a l l b l o o dv e s s e lc o u n t i n g ( n o o fv e s
8、 s e l s h p f , Ja s ) P 0 0 5V SM Ig r o u p ；尊P 0 0 5V SN Sg r o u p ；P O 0 5V SC Hg r o u p 3 3 心肌组织小动脉新生情况 a S M A 免疫组化染色切片在光镜下可见血管平滑肌阳性表达，N S 组、C H 组和C H + G F 组的动脉血管密度和血管成熟度较M I 组更明显，尤其是C H 组和 C H + G F 组( 见图6 7 7 0 ) 。 和M l 组和N S 组比较，C H + G F 组的小动脉( 1 0 1 0 0 u m ) 密度显著增加 ( P 0 0 5 ) ；和M I
9、组比较，N S 组、C H 组和C H + G F 组的动脉密度显著增多 ( P O 0 5 ) ，其中以C H 组最显著( 见表3 ) 。 表3 各组动脉血管计数( 个高倍视野，i 蛔) T a b l e3R e s u l t so fA r t e r i e sC o u n t i n g ( n o o fv e s s e l s h p f , ，a s ) 4 讨论 I P 0 0 5V sM Ig r o u p ：4P 2 0u m ) ，尤其是直 径大于1 0 0u m 的动脉，而对毛细血管( d 2 0u m ) 和小动脉( 1 0 - - 1 0 0u m ) 显
10、著增多，但是四组的微血管( d 0 0 5 ) ，其原因可能是微血管向小血管和小动脉分化。 本研究中，H E 染色、V W F 和a S M A 免疫组化染色均表明：N S 组、C H 组及 C H + G F 组的血管密度和血管成熟度较M I 组显著，尤其是C H 组及C H + G F 组。对于 重庆医科大学博士研究生学位论文 此研究结果，其可能的原因有：( 1 ) 喷射心肌打孔所产生的喷射可能对心肌组织 有一定的机械损伤，从而导致血管反应性增生；( 2 ) 在，I i , 肌孔道内填充的壳聚糖 具有促血管新生的作用；( 3 ) 血管生长因子( V E G F 和b F G F ) 具有显
11、著地促血管 生成作用。 本研究中V W F 和a S M A 免疫组化染色显示C H + G F 组孔道周围小血管和小动 脉较M I 组及N S 组显著增多，而且H E 染色和V w F 免疫组化染色显示壳聚糖凝胶支 架降解后，心肌孔道开放和内皮化，表明V E G F 和b F G F 的联合应用具有较好的促 血管新生作用以及促心肌孔道壁内皮化作用。 本研究表明，喷射心肌打孔填充壳聚糖凝胶支架及生长因子，能有效地促 血管新生和孔道形成。而孔道的形成及孔道周围组织内循环可能为局部缺血心肌 形成供血网络。 5 小结 ( 1 ) T M J R 可以促进缺血心肌组织的血管新生，尤其是小血管和小动脉的
12、血 管生成； ( 2 ) T M J R 可通过促进缺血心肌组织的血管新生，增加梗死心肌侧枝循环。 4 1 重庆医科大学博士研究生学位论文 第三节喷射心肌打孔填充凝胶支架对犬心室重构的影响研究 1 1 材料 1 1 1 实验动物 同本部分实验第一节 1 1 2 主要实验设备与药品 偏振光显微镜 天狼猩红 1 2 实验方法 日本O l y m p u s 美国S i g m a 公司 1 2 1 壳聚糖凝胶以及载生长因子的壳聚糖凝胶的制备： ( 1 ) 壳聚糖凝胶的制备：同本部分实验第一节 ( 2 ) 载生长因子的壳聚糖凝胶的制备：同本部分实验第一节 1 2 2 动物实验方案 ( 1 ) 动物分
13、组：同本部分实验第一节 ( 2 ) 动物实验方法：同本部分实验第一节 1 2 3 标本取材与处理： ( 1 ) 血流动力学参数测定犬饲养6 周后，用3 戊巴比妥麻醉犬，分离 右侧颈总动脉，结扎远心端，并在结扎线下方2 c m 处插入6 F 的动脉鞘，鞘内注 入普通肝素1 0 0 0 U ，经鞘将造影导管插入至左室内，连接换能器和多导生理记录 仪，实时记录心率( H R ，h e a r tr a t e ) 、左室内压峰值( L V S P ，l e f tv e n t r i c u l a rs y s t o l i c p r e s s u r e ) 、左室舒张末压( L V E
14、 D P ，l e f tv e n t r i c u l a re n d d i a s t o l i cp r e s s u r e ) 、左室 内压最大上升速率( + d p d t m a x ，m a x i m u mr a t eo fr i s e i nl e t tv e n t r i c u l a rp r e s s u r e d u r i n gs y s t o l e ) 、左室内压最大下降速率( - d p d t m a x ，m a x i m u mr a t eo f d e c r e a s ei nl e t t v e n t r
15、 i c u l a rp r e s s u r ed u r i n gd i a s t o l e ) ，并脱机分析( 见图7 1 ，7 2 ) 。 ( 2 ) 心脏重量指数测定：处死犬后，迅速开胸取出心脏，用冰生理盐水冲 洗，清洁滤纸吸干水分，切去根部血管，称取全心重量，切去双侧心房，分离左 右心室，清洁滤纸吸干水分后分别用电子天平称取左心室重量( L W ，包括室间 4 2 重庆医科大学博士研究生学位论文 隔) 和右心室重量( R V W ，主要为右心室游离壁) ，计算左右心室重量体重( B w ) 比值即为左、右心室重量指数( L V W I 、R V W I ，g K g )
16、。 ( 3 ) 计算心肌梗死面积：参照F r e y m a n 等人7 6 1 计算梗死面积的方法，分 离左心室，沿心内膜苍白区周边约lc m 处剪下梗死心肌组织，分别称重，以梗死 心肌组织重量左心室总重量1 0 0 作为梗死面积百分比。 ( 4 ) 天狼星红染色：将交界区的全层心肌组织用4 多聚甲醛固定，石蜡 包埋行苦味酸天狼星红染色。 1 2 4 病理切片制作及病理结构观察 ( 1 ) 苦味酸天狼猩红染色法染色 配制0 1 饱和苦味酸天狼猩红染料( 2 0 0m l 饱和苦味酸+ 0 2g 天狼猩红) 石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇至水，O 1 饱和苦味酸天狼猩红染色 9 0m i n ，流水冲洗5m i n ，苏木素伊红复染lm i n ，流水冲洗1m i n ，烤干后二甲苯 透明，中性树胶封片。 ( 2 ) 胶原容积分数测定 经苦味酸天狼猩红染色的切片，在偏振光显微镜下分为梗死区和非梗死 区，在交界区随
