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1、PCR技术的原理及应用,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,引物酶,引物酶,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,Kary B. Mullis,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,生物样
2、品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,DNA聚合酶,引物,引物,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,94变性,50-65退火,XX延伸,94,55,37,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,72,94,55,PCR循环,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮
3、,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特
4、点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用,提 纲,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,实时荧光定量PCR定义,常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。,实时荧光定量PCR 原理,实时定量PCR技术：,利用荧光信号的变化实时检
5、测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值,实时荧光定量PCR 原理,实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线,实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值,荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，
6、并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0
7、 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: lg M=lg X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: lg X0= - Ct lg(1+Ex) + lg M (3) Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。,实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含
8、的模板量。,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,Sample,实时荧光定量PCR原理 绝对定量,提 纲,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor,实时荧光定量PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记,实时荧光定量PCR 方法 1 SYBR Green 法,SYBR
9、Green 法,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。,SYBR Green,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),Tm,SYBR Green 法 融解曲线分析,Cycle number,SYBR
10、Green 法 定量原理,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少。 Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。,SYBR Green 法 -PCR反应的建立,反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同,SYBR Green 法 应用范围,起始模板的测定 基因型的分析 融解曲线分析：可以优化PC
11、R反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。,SYBR Green 法 优缺点,本单位目前开展的工作,多种病原体定量和定性 细胞因子检测（人，小鼠，大鼠等） 基因表达水平检测 PCR芯片,实时荧光定量PCR 方法2 -TaqMan法,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 （荧光共振能量转移原理，FRET） Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解
12、探针,TaqMan法 工作原理,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan 法 PCR反应的建立,1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ，45 S， 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相
13、同,已肝病人血液中HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 设置对照：浓度为106、105 、104 、103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数,利用TaqMan法 检测血液中的HBV,数据分析,分析结果： HBV DNA的精确copy数为 3.7X105,利用TaqMan法 检测血液中的HBV,sample,sample,TaqMan法 应用
14、范围,起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 单核苷酸多态性分析 (single nucleotide polymorphism ， SNP),TaqMan法 优缺点,实时荧光定量PCR 方法 3 - Molecular beacon 法(分子信标),标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,发夹型杂交探针,Molecular beacon (分子信标) 工作原理,荧光共振能量转移（FRET） 探针与DNA杂交时产生荧光 -延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号,Molecular beacon (分子信标) 应用范围,起始模板的定量 基因型分析 产物鉴
15、定 SNP分析,Molecular beacon (分子信标) 优缺点,几种方法总结,实时荧光定量PCR的实验设计和数据处理,绝对定量与相对定量,绝对定量与相对定量,绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度（DNA，RNA） 病毒DNA或RNA的拷贝数 转基因的拷贝数 相对定量：计算初始反应模板的相对含量 差异表达分析 芯片评估 转基因生物的检测 基因型检测,实时荧光PCR绝对定量方法,标准品，标准曲线 已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释 根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线 样品 与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值,使用实时荧光定量PCR进行绝对定量的优势,敏感性高 检测低拷贝数样品：单拷贝 区分小差异样品：24，48，96， 大范围拷贝数样品同时检测 100 1010 省时有效,实时荧光相对定量,相对定量的目的 比较基因在不同情
