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1、新疆医科大学 硕士学位论文 含IKVAV多肽自组装及对神经祖细胞的生物学活性的影响 姓名：巨啸晨 申请学位级别：硕士 专业：外科学 指导教师：盛伟斌 2010-04 摘 要 摘 要 - 1 - 含含 IKVAV 的多肽自组装纳米凝胶及其对神经祖细胞的多肽自组装纳米凝胶及其对神经祖细胞 的生物学活性的影响的生物学活性的影响 研究生：巨啸晨研究生：巨啸晨 导师：盛伟斌导师：盛伟斌 摘摘 要要 目的：目的：探讨 IKVAV 纳米纤维凝胶的合成及对神经祖细胞的生物学活性的影响。 方法：方法：1IKVAV 纳米凝胶纤维自组装：溶解 IKVAV-PA，控制其关键因素，体外诱 发 IKVAV 多肽的自组装，
2、通过透射电镜对自组装的纳米纤维凝胶进行观测。2神 经祖细胞的培养及鉴定：取出生 1-3 天的新生 SD 大鼠海马组织，采用无血清培养法 取得神经祖细胞，用免疫荧光法标记神经祖细胞进行鉴定。3含 IKVAV 的多肽纳 米纤维对神经祖细胞的生物学活性的影响：将第四代的神经祖细胞与 IKVAV 纳米凝 胶复合培养，分别于 2h、6h、12h、24h 观察神经祖细胞的贴壁及分化情况，计算神 经祖细胞的贴壁率及分化率，与对照组（未加入 IKVAV 纳米纤维凝胶组）进行统计 学分析。结果：结果：1实验成功合成了含 IKVAV 的多肽纳米凝胶，在透射电镜下可见 IVAV-PA 分子组成了直径为 5.09.0
3、nm 的纳米纤维，形成完整的三维网状结构，长 度可达数十至数百纳米，具有较强的细胞支撑能力。2合成的多肽纳米纤维与神经 祖细胞复合培养后生长良好，在复合培养不同时间后，神经祖细胞的贴壁率及分化 率均高于对照组（P0.05） ，有统计学意义。培养 24h 后，实验组有 90.7%NPC 贴 壁，几乎所有的细胞均开始分化；对照组有 10.3%的 NPC 贴壁，只有 7.7%的细胞分 化。结论：结论：IKVAV-PA 能够在体外自组装为多肽纳米凝胶，并体现了良好的生物相容 性，能够促进 NPC 的黏附与分化。 关键词：关键词：IKVAV-PA； 神经祖细胞； 纤维纳米凝胶； 自组装 新疆医科大学医学
4、硕士学位论文 新疆医科大学医学硕士学位论文 - 2 - Effects of self-assembled IKVAV peptide nanofibers on Neural Progenitors cells Ju xiaochen Shen weibing Abstract Objective: To make the bioactive IKVAVpeptide biomaterial self-assembled in vitro, and investigate its effect on neural progenitors cells (NPC) Methods: 1. Syn
5、thesize the IKVAV peptide biomaterial: Dissolve the IKVAV-PA, control the key factors, and use the solution with bivalent cation to seduce the IKVAV self-assembled in vitro. Use the Transmission Electron Micoscope (TEM) to investigate the IKVAV petide biomaterial. 2. Get the hippocampusof the SD rat
6、 (borned of 1-3d) , use the method of non-bloodserum to getNPC. Use the method of immunoflourescence to appraise NPC. 3. Foster the NPC (the fourth generation) with IKVAV-PA and observe the adhesive and differentiation of NPC at 2h, 6h, 12h, 24h, then analyse the rate of the adhesive and differentia
7、tion. Use the statistics method to analyse the disparity with the control group (without IKVAV-PA) . Results: 1. The IKVAV peptide self-assembled to produce nanofiber gel successfully. 2. The IKVAV-PA ismakd to nanofiber with its diameter of 5. 0-9. 0nm, and formd a figrure of three-dimensional reti
8、culation. It take on the length with number of count to hunders with a hardly shoring to the cells. 2. The NPC grew well whih IKVAV peptide, and the rate of adhesive and differentiation in the IKVAV peptide is higher than the NPC without the IKVAV peptide (P0. 05) . It has the statistics sense. Afte
9、r 24 hours, the rate of adhesive of the NPCs in the IKVAV petide is 90. 7%, and almost all the cells had differentiated. And the control group only has the 10. 7% cells adhesived and 7. 7% cells differentiated. Conclusion: IKVAV-PA could self-assembled to produce nanofiber gel and promte the adhesiv
10、e and differentiation of NPC. Key words: IKVAV; neural progenitors cells; Nanofiber gel; self-assembly. 英文缩略语表 英文缩写 英文全名 中文译名 NPC Neural Progenitors cell 神经祖细胞 SCI Spinal Cord Injury 脊髓损伤 3Tubuli 3微管蛋白 IKVAV soleucine- lysine- valine- alanine- valine 异亮氨酸- 赖氨酸- 丙氨酸- 缬 氨酸- 赖氨酸序列 Nestin 巢蛋白 LN lammini
11、n 层粘连蛋白 论文独创性说明 本人申明所呈交的学位论文是在我个人在导师的指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： 关于论文使用授权的说明 本人完全了解学校关于保留、使用学位论文的各项规定， （选择“同意/ 不同意” ）以下事项： 1 . 学校有权保留本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文； 2 . 学校有
12、权将本人的学位论文提交至清华大学“中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社”用于出版和编入 C N K I 中国知识资源总库或其他同类数据 库，传播本学位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名： 签字日期： 导师签名： 签字日期： 前 言 前 言 - 3 - 前前 言言 脊髓是周围神经作用于机体的中介通路，而脊髓损伤（spinal cord injury）及其 继发的病理生理改变可直接导致神经功能的丧失，其较高的致残率和致死率使其成 为临床治疗的世界性难题。随着神经组织工程学的兴起，细胞移植为脊髓损伤带来 了曙光，并在动物试验中取得了令人鼓舞的进展。近年来，神经干细胞移植及其基 因治疗相结合的联
13、合治疗已成为研究的热点。 脊髓损伤的机制目前尚不清楚，但以往的研究表明，脊髓损伤主要包括脊髓的 原始损伤和继发损伤。脊髓的原始损伤直接作用于脊髓神经元细胞，而引起神经元 的变性、坏死；继发损伤相对复杂，概括起来主要是损伤后的神经细胞周围环境的 改变及神经性反馈导致的脊髓神经细胞的二次受创1-3。 所以， 针对脊髓损伤的机制， 治疗的关键在于脊髓损伤后神经细胞的再生与细胞微环境的改善。近年来随着组织 工程技术的兴起、神经干细胞的研究及其在生命科学等领域的广泛应用，神经干细 胞作为种子细胞以“种子细胞+神经营养因子+生物支架”这一模式治疗 SCI 的可行性 及其动物试验效果为 SCI 的治疗提出了
14、新的方向4。 神经干细胞具有自我更新、 自我 分化成神经元、少突角质细胞和星形胶质细胞的多分化潜能。1992 年 Reynolds 等从 成年小鼠的纹状体分离出能在体外不断分裂增殖，并具有多种分化潜能的细胞，首 次提出了神经干细胞的概念。2000 年 Gage 进一步概括了神经干细胞的特性为5：可 生成神经组织或来源于神经系统；具有自我更新能力；可通过不对称细胞分裂产生 的细胞；具有迁移能力，能到达损伤或疾病的部位并产生新的神经细胞。神经干细 胞通过两种方式分裂增殖：对称分裂和不对称分裂：对称分裂可以产生两个神经干 细胞或是两个神经祖细胞，神经祖细胞是相对神经干细胞而言，其分化和自我更新 的能
15、力受到了限制，仅具有单项分化的潜能或其干细胞的特性只能维持较短的时间， 这就使得祖细胞向神经终末细胞分化的潜能强于神经干细胞，并成为细胞移植的首 选细胞。 另外， Lu6等研究表明， 神经干细胞移植自身能分泌各种营养因子， 如 BDNF、 NG-3 和胶质细胞源性神经营养因子（GFNF）等。神经干细胞移植后自身分泌的营 养因子不仅可以在体外定量检测到，而且能将其植入脊髓损伤的大鼠体内后，仍然 可以检测这些神经营养因子较高水平的表达，并能促进对这些神经营养因子敏感的 轴突生长。这样，既能够代替受损伤而丢失的神经细胞，又提供了神经细胞生长过 程中所需的营养因子。所以，神经干细胞作为理想的种子细胞，
16、是目前移植前景最 大的细胞之一。 在神经的发育和再生过程中，细胞外机制对于神经轴突的再生有重要的意义。 细胞外基质分子填充了细胞间的空隙，围绕在细胞周围形成特殊的细胞外环境。当 神经细胞与细胞外基质相接触时候，细胞外基质中的生物活性物质对神经细胞间的 新疆医科大学医学硕士学位论文 新疆医科大学医学硕士学位论文 - 4 - 连接和行为产生了重要的作用。层粘连蛋白（laminin）是神经系统中最早发现的细 胞外基质分子之一，它是一种大型的多区域的，十字形状的糖蛋白，分子量大约是 850KDa7。层粘连蛋白有很多区域结构分子，由多肽功能片段组成，如 链上的 IKVAV 和 LQVQLSIR 序列可以促进神经细胞的粘连和神经轴突的生长， 链上的 YIGSR 序列可以促进细胞黏附， 链可以促进运动神经元再生过程中突触形成和前 突触的分化。IKVAV 序列（异亮氨酸-赖
