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1、哺乳动物细胞核移植教案Chapter One Nuclear Transplantation of Mammalian cellscartoonyang（中国生命科学论坛动物科学与动物医学 第1版主）摘要：本文综述了近年来哺乳动物细胞核移植的相关进展。关键词：哺乳动物 细胞 核移植 进展IntroductionThe merge of a sperm and an ovum (fertilization) recovers the diploid cell marking the beginning of the individual development. In the embryonic
2、 development, various types of cells are originated from the zygot such as muscle fibers, neurons and hemocytes etc. A question has been asked if the differentiated cells in the development could resume the initiation status or pluripotent stage under proper circumstances which could give rise to ot
3、her tissues and even the body as a whole. Is the process irreversible? To answer the question, the famous German embryologist Spemman brought out the idea to transplant the nuclei of cells in the anaphase of development to denucleated ova restarting the process in 1938. The aim of the experiment is
4、to testify the totipotency of partially or completely differentiated cells. In 1952, Briggs and King conducted the first nuclear transplantation in tadpoles. 1n 1962, the nuclei transplant of gastrula endoblast bred fertile xenopus, which demonstrated the cells post gastrula stage do not undergo irr
5、eversible change. All these experiments show the inferior creatures like amphibian possess at least part of differentiated somatic cells could recover their totipotency to develop to adult stage with the effect of oocyte cytoplasma and this has laid the foundation for mammalian nuclear transplantati
6、on.引言一个精子和一个卵子的结合（即受精），恢复二倍体，从而开始了一个个体的发育。在胚胎发育过程中，很多不同类型的细胞都是由受精卵发育开始的。它们有一些专门发育为肌肉细胞，有一些发育为神经细胞，还有发育为血细胞等。从这里就引出了一个问题：在哺乳动物胚胎发育过程中，细胞发生了分化，但是在适宜环境下，已分化的细胞能否重新恢复到发育的起始状态，再重新发育成其它类型细胞组织的多能性，甚至发育成完整个体的全能性呢？细胞的分化是不是发生了不可逆的变化？为了回答这个问题，早在1938年，德国著名胚胎学家Spemann提出了将发育后期的胚胎核移到无核的卵子中使其重新发育的设想，实验的目的就是为了检验部分分化
7、或完全分化细胞的全能性。他通过头发结扎将蝾螈的受精卵一分为二，有核部分可正常发育和卵裂，并发育到16细胞期，无核部分当移入另一个卵裂球的细胞核时，也能发育成为正常的幼虫，证实了蝾螈未分化的卵裂球具有发育的全能性。1952年，Briggs和King等将已发生了分化的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚，最后发育出了完整的蝌蚪。这是首次进行的细胞核移植尝试获得成功。Gurdon等（1962）利用原肠期内胚层细胞进行核移植，分别产下可育爪蟾。由此证明：自原肠胚以后的细胞仍然没有发生不可逆的改变，可以支持核移植胚发育到成体。这些实验结果证实，两栖类等低等动物至少有部分已分化的体细胞在卵母细胞质的作用
8、下，可以恢复其全能性而重新发育到成体。这也为哺乳动物核移植奠定了基础。1哺乳类动物细胞核移植研究进展1.1哺乳类动物胚胎细胞核移植研究进展哺乳动物核移植研究始于1975年，研究远远晚于两栖类动物，其主要原因是由于哺乳动物的受精在体内发生，而且哺乳动物早期胚胎的体外培养（In Vitro Culture, IVC）技术和早期胚胎显微操作技术在当时没有建立起来。牛津大学Bromhall（1975）将兔子的胚胎细胞核移植到未受精的卵母细胞内，部分可发育到囊胚阶段，但成功率相当低。由于不能进行染色体和供体特异性标记分析，因而这些发育的胚胎来源是否是注入的细胞核，或者是胚胎自身的细胞核都不能作一清楚的解
9、释。鉴于当时的哺乳动物核移植理论和技术都尚未完善，人们大多将研究的重点放在了卵裂球的分离和胚胎切割上。然而，由于胚胎分割和卵裂球分离技术本身的局限性，动物克隆的数量非常有限，未能达到人们所希望的预期效果，于是人们一直也在探索动物核移植的克隆方法。在1981年， Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的内细胞团（Inner Cell Mass, ICM）的细胞核移植到去核的受精卵内，获得了首批克隆的小鼠。这是世界上首次获得哺乳动物克隆成功的报道，但是其实验未被其他的研究人员所重复，人们仍对核移植技术仍缺乏信心。直到1983年这种局面才被Mcgrath和Solter打破，他们首次利用显微操作技术
10、和细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核移植效率大大提高，人们对核移植技术的应用前景看到了希望。随着核移植技术程序的建立，哺乳动物细胞核移植的研究发展很快。1986年，Willadsen等用绵羊早期胚胎的卵裂球作供体，用去核的第二次减数分裂中期（Second Meiotic Metaphase, MII）卵母细胞作受体，并用电融合的方法代替了仙苔病毒诱导供体卵裂球与去核卵母细胞融合，研究发现电融合方法比病毒融合法更有效，核移植胚胎的体外发育能力更强，重组胚移植后获得了核移植后代，这是首次在家畜上获得了成功。他们的实验阐明了哺乳动
11、物胚胎细胞核移植中两个全新的观念：（1）作为核受体，卵母细胞比受精卵有更大的优越性；（2）绵羊桑椹胚的细胞核具有发育的全能性，并建立了以早期胚胎卵裂球为供体， MII期卵母细胞为受体胞质以及用电融合方法诱导供体细胞核和受体胞质融合这一整套技术。该技术极大推动了核移植技术的发展，并成功运用于其它动物，获得了胚胎克隆牛（Prather et al, 1987）、兔（Stice & robl, 1988）、猪（Prather et al, 1989），和猴（Meng et al, 1997）等。虽然胚胎细胞核移技术的发展总体相似，但是各动物胚胎细胞核移植的发展过程是有所不同的，下面将分别对各种哺乳动
12、物的胚胎细胞核移植技术研究进展作一简单的概述。1.1.1小鼠 小鼠的胚胎细胞核移植的研究开展较早，也是最早获得了核移植后代。1981年，Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的ICM细胞核移植到去核的受精卵内，获得了首批克隆小鼠。1983年，Mcgrath和Solter首次利用显微操作技术和细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核移植效率大大提高。除了这些取得突破的研究外，Hoppe和Illmensee（1981）的研究证明了孤雌生殖胚胎的ICM细胞含有发育个体所需的所有基因，这些细胞具有发育的全能性。在细胞周期的调整和核质互作
13、上，Cheong等（1993）发现细胞周期早期的胚胎细胞核在受体细胞质中可以发生发育程序的重排，核移植胚胎的发育率明显提高，并获得了核移植后代。1996年，Kwon和Kono等通过改进方法，获得了4个和6个遗传上完全相同的继代核移植后代。另外有研究表明，小鼠囊胚期的滋养层细胞与ICM细胞一样具有发育的全能性（Tsunda & Kato, 1997; Sotomaru et al., 1999）。1.1.2 牛 实验动物中的胚胎细胞核移植研究为家畜的核移植研究奠定了扎实的技术基础。而在家畜中，牛的胚胎细胞核移植研究的历史较为久远，研究的投入是最大的，也取得了丰硕的成果。1987年，Robl等首次
14、进行牛的核移植研究，他们将1-8细胞期胚胎的细胞核移到去核的合子内，结果1-细胞期胚胎的细胞核移植后构成的重组胚可以发育到出生，而处于其它细胞期的胚胎细胞核移植后均不能支持重组胚发育超过4-细胞期。同年，Prather等（1987）用Willadsen相同的核移植技术程序（Willadsen, 1986），将16-32细胞期胚胎的卵裂球移入去核的体内或体外成熟卵母细胞内，最后出生了1头核移植牛犊，其成功率为1%。Bondioli等（1990）用16-64细胞期胚胎作核移植供体，获得了7头来自同一核供体胚胎表现型的牛犊，移植的成功率达20%。Stice和Keefer（1993）获得了54枚来自同
15、一供体胚胎的克隆胚胎，其第一、二、三代克隆胚胎移植后均产下了牛犊。Ector等（1995）克隆与再克隆囊胚发育率（12.9%与14.9%）和妊娠率（35.7%与33.3%）没有差异性。而Heyman等（1995）用体外受精（In Vitro Fertilization, IVF）胚胎作为核移植供体，核移植胚胎的囊胚发育率达到了22.6%，这与体内胚胎作为核移植供体核的囊胚发育率相似（30.2%）。而在国内这方面的研究也取得了进展，李雪峰等（1996）成功的获得了我国第一头胚胎克隆牛。1.1.3猪 1989年Prather等利用合子间的原核交换，并利用电脉冲使供体原核和去核合子融合，得到了7头仔
16、猪，而利用2-8细胞期胚胎的核融合去核的MII期卵母细胞，体内移植后形成11%的桑椹胚，移植88枚核移植胚胎至受体母猪仅生下了1头仔猪，成功率不到1%。因此后来的研究也着重转向影响猪胚胎细胞核移植的因素。同牛一样，猪的核受体卵母细胞既可用体内成熟的也可用体外成熟的（Prather et al., 1991）。但由于当时卵母细胞的体外成熟培养系统还不够完善，使得体外成熟卵母细胞质量较差而不能完成胚胎的体外发育全过程（Nagashima et al., 1992）。Prather等（1990）在研究发现，猪核移植胚发生了发育程序的重排，出现供体核膨胀，并认为核的膨胀程度与卵裂球的发育时期无关。在猪卵母细胞激活上，研究表明：采用合适的场强1次电脉冲就足以激活猪卵母细胞，增加脉冲次数并不能提高激活率（Prather et al., 1989; Prochazka et al., 1992; Nagashima et al., 1992; 赵浩斌等, 1999）。而在胚胎发育的早期阶段基因表达和蛋白质合成
