《高通量分离技术研究进展》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高通量分离技术研究进展（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、http:/www.hxtb.org 化学通报 2006 年 第 69 卷 w013 高通量分离技术研究进展 李晓琳 包建民* (天津大学药物科学与技术学院 天津 300072) 摘 要 随着组合化学、 基因组学和蛋白质组学等药物研发相关学科的发展， 药物分析正面临着 前所未有的压力。样品复杂度越来越高，样品分析量越来越大，复杂的样品要求更好的分离手段，大 量的样品则要求更高的分析通量。因此，以液相色谱、毛细管电泳、微芯片、质谱等现代分离技术为 基础的各种高通量药物分析新技术应运而生。本文对这几种高通量药物分析新技术的研究及应用作一 介绍。 关键词 高通量 液相色谱 毛细管电泳 微芯片 质谱
2、Advancement of High-throughput Separation Technologies Li Xiaolin, Jim Bao* (College of Pharmaceutical and Biotechnology, Tianjin University , Tianjin 300072) Abstract With the rapid development in combinatorial chemistry, genomics, proteomics and other subjects related to drug discovery and develop
3、ment, the pharmaceutical analysis is under a lot of pressure to keep up with the pace. Analytical chemists in pharmaceutical industry have to deal with more complex samples in even larger quantities. Therefore, there is a constant need for better analytical tools to handle both the sample complexity
4、 and throughput issues. While separation is the key to the success of dealing with sample complex, large amounts of the samples have to meet the demand of high throughput. In the last few years, rapid progresses have been made in improving the throughput of various separation based analytical techni
5、ques such as HPLC, HPCE, microchips and MS. This paper provides a systematic review of these techniques, as well as their use in pharmaceutical industry. Key words High-throughput, LC, CE, Microchip, MS 药物研发是一项周期长、投入高、风险大的工程。一个新药从合成到产品投放市场需要十年 以上的时间。为了在专利保护期内产生最大效益，医药公司都希望尽量缩短研发时间。对于一个 年销售额为 3 亿美元的普
6、通药，推迟一天上市，便会造成至少 100 万美元的损失1。在激烈的市 场竞争中，能否提高药物研发效率和成功率，缩短研发周期，已经成为医药公司生存的关键。20 世纪 90 年代发展起来的组合化学技术， 为新药的发现提供了大量的化合物(一般达每周上千个化 合物2)，这对与之配套的仪器规模和分析通量提出了更高的要求。与此同时，人类基因组计划 的提前完成，使人类进入后基因时代，药物研发到了根据基因特点、代谢特点、功能特点等进行 “量体裁衣”的新阶段3。随之发展起来的被称为后基因组学的蛋白质组学，将为新药开发提供 李晓琳 女，26 岁，硕士生，现从事药物分析新方法的研究工作。*联系人，E-mail: j
7、im_bao 教育部重大培育项目(704013)和教育部李嘉诚基金资助项目 2005-05-07 收稿，2005-07-26 接受 http:/www.hxtb.org 化学通报 2006 年 第 69 卷 w013 2 更多新的药物作用靶点，从而为药物研发带来新契机。在基因组学和蛋白质组学的研究热潮中， 基因测序工作繁重耗时， 蛋白样品通常由样品量跨越几个数量级范围的数千种蛋白组成。 样品的 高度复杂性要求其分离、纯化、鉴别、定量分析等具有极高的分离能力和分辨率，而繁重的重复 性工作则要求更高的通量。因此，在短时间内能尽可能多地提供完整且有用信息的高效、快速和 高通量的药物分析技术在 20
8、世纪 90 年代应运而生。 高通量药物分析技术主要用于药物研究的发现阶段，这一阶段也是药物研究的基础和关键。 在研发阶段，高通量分析也可以提高研发效率。在临床阶段，一些生物分析也可向高通量方向改 进，从而缩短新药研究乃至上市的时间。 20 世纪 80 年代发展起来的以 96 孔模板为基础的高通量筛选系统为高通量药物分析奠定了 物质基础。 传统的高通量药物分析是在 96 孔模板的尺寸基础上增加孔密度， 从而产生了 384 孔， 甚至 1536 孔模板。虽然它们具有快速、高通量的特点，适合初步筛选，但其分离能力有限，准 确性较低，其结果还需作进一步的确认分析。随着 96 根毛细管电泳等新技术的不断
9、涌现，以高 效液相色谱(HPLC)、高效毛细管电泳(HPCE)、微流控芯片(microchip)、质谱(MS)等现代分离技 术为基础的高通量药物分析新技术近年来获得了迅猛的发展。 1 高通量液相色谱 高通量液相色谱主要用于组合化学库中大量化合物的分析和纯化、 蛋白质组学分析、 ADMET (absorption, distribution, metabolism， excretion and toxicity)筛选和临床前与临床研究中的生化指标 的分析4。该技术是通过对传统高效液相色谱的进样系统、输液系统、检测系统进行改进，从而 显著提高其分析和纯化通量。它可分为串联高通量系统(Serial-
10、LC)和并联高通量系统 (Parallel-LC)。 1.1 串联高通量系统 Serial-LC 通过减少样品分析时间和循环时间来实现高通量。进样采用自动化程度更高的进 样器或在液相与质谱的接口上采用流动注射分析(flow injection analysis，FIA)5。输液系统的改 进主要是减少梯度洗脱时间，由传统的 3060min 减至 5min 以下6；也可由缩短柱长和提高流 速的方法来减少洗脱时间。在蛋白质组学的研究中常采用二维液相色谱技术(2D-LC)来提高分析 效率，从而实现快速、高通量的蛋白质分析。一维上主要用离子交换色谱，此外也可用亲和色谱 或分子排阻色谱；二维上主要用反相液
11、相色谱7。为了实现快速检测，可根据样品自身特性选择 最适宜的检测器，例如氮化学发光检测器(CLND)8和蒸发光散射检测器(ELSD)9等，或多种检 测方式联用(例如 UV/MS)。此外还可以改进数据处理系统。 1.2 并联高通量系统 高通量液相色谱的更重要的发展趋势是并联系统。该系统具有多个色谱柱(例如 4、6 和 8 通 道等)，单一或组合的高压梯度系统，多通道检测装置以及智能化、自动化的监控系统与相应的 分析软件。该系统可实现多个样品的同时分离和纯化，因而具有比串联系统更高的通量。 1.2.1 进样机制 并联系统的进样可利用普通泵，通过转动多位阀从自动进样器中进不同的样品。 例如 2002
12、 年 Lee 等10研制的 4 通道毛细管液相色谱系统。 1.2.2 输液机制 Parallel-LC 的输液系统主要采用微流控泵和 T 转接口或是普通泵和分流器。 Lee http:/www.hxtb.org 化学通报 2006 年 第 69 卷 w013 3 等10使用了一个微流控泵和 2 个 T 转接口将梯度流动相均匀输送到 4 个反相 C18柱子中。 而德国 Sepiatec 公司的 8 通道制备色谱系统则采用两个普通泵和一个分流器将甲醇和水分别输送到 8 个 制备柱中，该系统能够在 24h 之内将多达 5g 的天然植物或复杂物质全自动的分离成 300 多种单 一化学组分11。2001
13、 年，Feng 等12开发了 10 个泵、8 通道的并联 LC/MS 全自动蛋白质分析系 统，其中两个泵与分流器联用来实现二元溶剂的梯度混合，其余八个泵用来输送流动相。 目前，Parallel-LC 的输液系统正朝着新方向发展。Eksigent 公司正努力将微流控、微型泵、 微加工技术相结合，开创一套全新的输液系统13。在刚刚召开的 2005 年美国匹茨堡年会上， Eksigent 公司又展出了基于 16 个泵的完全独立的 8 通道二元混合梯度系统。 1.2.3 检测机制 基于质谱在痕量分析和结构表征方面的优势， 高通量液质联用技术(LC/MS)已成 为 Parallel-LC 的重要组成部分
14、。此外 Parallel-LC 还可采用双波长或可变波长的紫外吸收以及紫 外与质谱相结合等检测方式。 由于质谱造价很高，每个通道都连接一个质谱将会大大提高整套系统的成本。因而，可实现 Parallel-LC 与一个质谱联用的多通道电喷雾电离接口(multiplexed electrospray interface，即 MUX 接口)13成为高通量液质联用技术的发展主流。目前大部分高通量平行 LC/MS 系统均采用 MUX-LCT(LC-Time of Flight mass spectrometer)技术。LCT 即利用电喷雾电离接口或大气压化学 电离接口来实现液质联用，进行常压电离分析的直角
15、加速飞行时间质谱14，是一种快速、高灵 敏度和高分辨率的收集质谱。 MUX-LCT 即是采用 MUX 接口使液相与飞行时间质谱联用的技术。 MUX 充分利用了 LCT 快速收集数据的特点，可在极短的时间内扫描各个通道。Biasi 等15研制 的 4 通道 LC/MS 系统扫描每个通道的时间为 0.8s。Sage 等16的 4 通道和 8 通道系统的循环时间 分别为 0.6 和 1.2s。Fang 等17开发的 8 通道并联 LC/UV/MS 扫描 8 个通道仅需 1.6s，可以 24h 全自动运行，并可实现每天分析 3200 个样品的高通量。2003 年，该小组又开发出了 9 通道的平 行 L
16、C/UV/TOF-MS 高通量分析系统，增加的通道采用 UV 检测，用于引入内标物质进行质谱锁 定纠正仪器漂移18。 此外， 在蛋白质组学研究中， 能够把从多元平行液相色谱柱中洗脱出来的多肽解析到基质辅 助激光解析电离接口(MALDI)的探针上的多通道解析系统也可以实现并联 LC 与质谱的联用19。 Wall 等20开发了能够连续收集洗脱液的解析系统。Ericson 等21证明了利用脉冲电场可以把洗脱 液从多元平行液相色谱柱中直接转移到 MALDI 探针上，无需使柱子出口与探针接触。 2 高通量毛细管电泳 由于具有分离效率高、 分析速度快、 试剂消耗少、 样品体积小等特点， 高效毛细管电泳(HPCE) 是类药化合物和生物大分子(如蛋白质和 DNA)的重要分析手段。同其它色谱技术相比，高效毛 细管电泳更易于实现高通量和自动化。它可在多
