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1、分析与检测 2009年第35卷第9期(总第261期)119 高效液相色谱 2荧光检测法测定罐头食品中的 双酚A、BADGE及其衍生物 葛宇 1 ,印杰 1 ,曹程明 1 ,叶天 2 ,宁啸骏 1 ,虞成华 1 ,熊薇 1 ,忻元庆 3 1( 国家食品质量监督检验中心(上海 ) / 上海市质量监督检验技术研究院,上海, 200233) 2( 华东理工大学生物工程学院,上海, 200237) 3 ( 上海市质量技术监督局,上海, 200233) 摘 要 研究建立了一种罐头食品中的双酚A、BADGE及其衍生物含量的高效液相色谱 2 荧光检测法。前处理 包括乙腈萃取,超声,旋转蒸发,压滤等步骤。样品经
2、ZORBAX SB - C18柱 (4 16 mm250 mm)分离,以0102 mol/ L乙酸铵溶液和甲醇为流动相,在激发波长225 nm、 发射波长305 nm下进行荧光检测。检出限达到0104 - 011 g/mL。6次重复实验的相对标准偏差分别为BADGE2H2O 0160%、BPA 0183%、BADGEH2O 1102%、 BADGEH2OHCl 0166%、BADGE 0159%、BADGEHCl 0137%、BADGE2HCl 1181% ,方法回收率分别为 BADGE2H2O 93% - 105%、BPA 97% - 104%、BADGEH2O 85% - 101%、BAD
3、GEH2OHCl 92% - 102%、 BADGE 96% - 99%、BADGEHCl 95% - 106%、BADGE2HCl 87% - 111% ,满足痕量分析要求。该方法简便 快速,灵敏可靠,适用于罐头食品中双酚A和6种BADGE衍生物含量的同时检测。 关键词 高效液相色谱 2 荧光法,罐头食品,BADGE及其衍生物,检测 第一作者:硕士研究生。 3 上海市质量技术监督局立项资助项目(No. 06TBT11) 收稿日期: 2009 - 05 - 20,改回日期: 2009 - 08 - 05 双酚A (BPA) ,双酚A二缩水甘油醚(bisphenol A diglycidyl e
4、ther,BADGE) ,是一种环氧化合物,由于 其可以作为环氧树脂的合成起始物质和一种清除过 量氯酸的添加剂使用在PVC粉状树脂的生产中,因 而广泛应用于罐头食品的内涂层材料中。因BADGE 亲脂性以及水解性,使其很容易从罐头的内涂层向含 有油脂或水分的罐头食品中迁移,并生成多种衍生 物,如BADGE2H2O,BADGEH2O,BADGEH2O HCl, BADGE. HCl和BADGE. 2HCl。资料表明, BADGE及其衍生物是潜在的内分泌干扰因子,其毒 性的大小主要取决于未反应的环氧基团的浓度,并因 为环氧化合物是烷化试剂,在细胞分裂速度较快的器 官有着较高的细胞毒性反应 1 。 基
5、于新的毒理学对于双酚类物质的评估已经反 映在新的欧盟法令(从2006年1月1日起生效) EC. NO. 1895 /2005上,它规定了一些特定环氧衍生物在 用作与食品直接接触的材料中的使用限量,并且定义 了两类BADGE组分的特定迁移限量( S ML) : (1) BADGE以及它的水解产物在食品及食品模拟物中的 迁移总量不超过9 mg/kg; (2)BADGE氢氯化产物在 食品及食品模拟物中的迁移总量不超过1mg/kg。禁 止使用BFDGE( (双酚F二缩水甘油醚)和NOGE(线 型酚醛清漆缩水甘油醚 ) , 但在这之前生产的产品仍 然允许出售 2 。我国出口到欧盟的罐头制品 ,部分 因双
6、酚A或BADGE环氧衍生物检测不合格而被退 回,面对欧盟的贸易壁垒,我国食品行业急需一种适 合我国国情,切实有效的双酚A、BADGE及其环氧衍 生物的检测手段。 1 材料与方法 111 主要仪器与试剂 高效液相色谱 2 荧光检测器(Waters公司 ) ,0 122m 微孔滤膜过滤器(Waters公司 ) , 旋转蒸发仪(德国Hei2 dolph公司) , SK3310HP超声振荡仪(美国KUDOS公 司)。 双酚A、BADGE及其衍生物标准品(纯度 9918 % ) (Fluka公司 ) ; 乙酸铵(国药集团化学试剂有限公 司 ) ; 甲醇(色谱纯) ( Fisher公司 ) ; 乙腈(色谱
7、纯) (Fisher公司 ) ; 除非有特别说明,所有试剂均为分析 纯,水为符合GB /T 6682规定的一级水。 乙酸铵缓冲溶液 (0 102 mol/L) :准确称取1154 g 乙酸铵并加水溶解后转移至1L容量瓶中,用蒸馏水 定容,备用。 标准储备溶液(200g/mL) :准确称取0101 g的 食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATI ON I NDUSTRIES 120 2009 Vo l135 N o19 (To ta l261) 双酚类标准样品(精确至011 mg)于50 mL棕色容量 瓶中,用甲醇溶解并定容,制备成200g /mL标准储 备液, 4 以下避光保存备用
8、,有效期为3 m。 标准工作溶液:根据实验需要配置适合浓度的标 准系列溶液,所用的定容试剂为甲醇(储存条件: 0 - 4 避光放置,不得超过3 d,建议现配现用)。 112 色谱条件 液相色谱柱: ZORBAX SB - C18柱 (4 16 mm250 mm) ;柱温: 30;样品温度: 25;流动相: A为 0102mol/L乙酸铵溶液, B为甲醇,梯度洗脱条件见 表1;流速: 110 mL /min;进样量: 10L; ;激发波长: 225 nm;发射波长: 305 nm。 表1 流动相梯度条件 时间/min流量/ (mLmin- 1)A /%B /%曲线 10101140606 251
9、40606 328120806 430120806 532140606 640140606 113 样品前处理 称取5g经研磨粉碎后的样品(精确至1 mg)置 于50 mL容量瓶中,加入25 mL乙腈,超声30 min,再 用乙腈定容至50mL。将样品提取液通过滤液漏斗, 并收集滤液。 用移液管移取25 mL滤液至圆底烧瓶中,置于 旋转蒸发仪上,在 (40 1) 水浴中真空浓缩至干, 在圆底烧瓶中加入215 mL乙腈,在超声水浴中重新 溶解分析物。重溶液过0122m微孔滤膜过滤器, 收集滤液上HPLC测定。 2 结果与讨论 211 液相条件的优化 为了建立一个适用于不同实验室条件下的检测 方法
10、,文中对不同分析条件进行研究。实验发现,柱 温在20 - 30 内并不影响分析物的分离效果,但保 留时间随着柱温的升高略有降低。另外,也尝试了不 同色谱柱的应用,如SH ISEI DO CAPCELL PAK C18 MGS5 (416 mm150 mm)柱,发现不同型号的反 相C18柱对分析物的分离的影响不大。经过反复测 试,选择了实验室较常用的,选择性最好的Agilent ZORBAX SB2C18柱 (4 16 mm250 mm)柱来进行以下 的实验。 本研究涉及的BPA、BADGE及其衍生物一共有 7种,包括BADGEH2O, BPA, BADGE2H2O, BADGEH2OHCl,
11、BADGE, BADGEHCl和 BADGE2HCl,其物理化学性质相差较大,极性差别 十分明显,实现完全分离并不容易,为了限制整个分 析过程的持续时间并且不增加极性分析物的保留时 间,试验引进了梯度洗脱,使得7种物质在较短时间 内得到完全分离,且峰形较好(见图 1) 。 图1 梯度洗脱对BADGE及其衍生物保留时间的影响 (a 为梯度洗脱; b为等度洗脱) 在流动相中加入一定比例的有机相能够改善峰 型,但在有机相的选择上,不同有机相含量可能对分 离造成不同的影响,目前常用的是甲醇或者乙腈 3 。 本实验比较了不同有机相对目标物出峰影响的色谱 图(见图2) ,最终选择了甲醇作为有机相。从图2中
12、 可以看出,选择甲醇作为有机相, 7种物质完全得到 分离,而使用乙腈,则分离度不佳, BPA, BADGE H2O与BADGEH2OHCl这3个峰几乎黏到了一 起,尽管进行了梯度调整,也无法得到完全分离。 分析与检测 2009年第35卷第9期(总第261期)121 图2 有机相对BADGE及其衍生物分离的影响 (a 为甲醇; b为乙腈) 212 前处理条件的优化 21211 提取剂的选择 从食品基质中萃取BPA,BADGE及其衍生物,目 的是为了使所有的分析物达到最大的萃取回收率。 本研究试验了许多不同极性的物质,发现用乙腈从食 品基质中萃取的结果是最好的, 7种物质的回收率均 在90%左右。
13、 21212 超声时间的确定 超声时间对萃取效率有一定的影响。选取了 10, 20和30 min作为低,中,高3个时间点,在相同条 件下对分析物进行测定,发现样品的回收率有着较大 的区别:超声10 min的样品回收率为65% - 73% , 20 min的样品回收率为79% - 86% , 30 min的回收率都 达到了90%以上。因此,最终选择了超声时间为30 min,以获得最佳的回收率。 21213 浓缩条件的选择 为进一步提高方法检出限,采用了浓缩的方法, 通过使用真空旋转蒸发仪将溶剂蒸干,再加入乙腈重 新定容,使得分析物的浓度浓缩了10倍,图3为加标 浓度为0110 mg/L时样品谱图
14、,分离效果良好。 图3 0110 mg/L加标回收率图谱 213 方法参数研究 21311 线性与检出限 线性范围是指试样量与响应讯号之间保持线性 关系的范围。将浓度为0 - 210g/mL双酚A、 BADGE及其衍生物的标准溶液进样,以系列浓度与 对应的峰面积所得直线线性相关系数。本实验定义 3倍基线噪音时样品的浓度作为定性检出限,取 BADGE混标标准溶液c= 0102 mg/L标样在相同条 件下进样6针,测得6次样品的信噪比,按检出限定 义,计算该条件下BADGE及其衍生物的定性检出限 见表1,定量检出限按10倍基线噪音计算,具体数值 见表2。 表2 方法线性与检出限 线性方程 相关系数
15、 R 检出限(LOD) / ( gmL - 1) 检出限(LOQ) / ( gmL - 1) BADGE2H2Oy=1E +07x+ 76 02401999 90101601054 BPAy=6E +06x+ 4 3961201999 90103401114 BADGEH2Oy= 1E +07x+ 48 05501999 90101601053 BADGEH2OHCly= 8E +06x- 10 51301999 50102301075 BADGEy= 1E +07x+ 38 62201999 90101301043 BADGEHCly= 1E +07x+ 45 35611000 001013
16、01044 BADGE2HCly=1E +07x+ 19 38301999 90101401047 食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATI ON I NDUSTRIES 122 2009 Vo l135 N o19 (To ta l261) 21312 精密度及加标回收率 重复性是指在重复性条件下所测得的相互独立 的实验结果之间的符合程度,在相同的检测条件下连 续测定6次,测定每个分析物相应的精密度见表3。 根据113所述的前处理方法分别对阴性食品基质进 行低、 中、 高3个浓度加标,然后在相同的检测条件下 测定回收率,检测结果如表3所示。加标回收率在 87% - 111% ,相对偏差(RSD) 3 %。由此可知,本 方法具有较高的准确性。 表3 方法精密度及加标回收率(n=3) RSD /% 加标量/ (gmL - 1) 回收率/% 0102104151 BADGE2H2O016010593198 01195182 010296
