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1、地中海贫血基因诊断,LOGO,地中海贫血,1925年,Cooley描述了一个幼儿患有贫血,并伴发有有核红细胞增多症.此后,意大利,希腊等地中海区域也陆续发现并报道类似疾病,因该病首先在地中海区域发现,因此被称为地中海贫血.(thalassemia).,“地中海贫血症”来源,地中海贫血症介绍,地中海贫血(THAC)是一种较为常见的单基因遗传性疾病，多出现在我国的南方各省，又以海南及两广沿海地区多发。 其主要致病机制为珠蛋白或珠蛋白基因出现缺失或具有缺陷，从而引起血红蛋白中不同肽链出现合成比例失衡，进而导致了溶血性贫血疾病的发生。,珠蛋白基因的结构及表达,1.珠蛋白基因的结构,珠蛋白基因簇 16p
2、13,珠蛋白基因簇 11p15,地中海贫血的分型,地中海贫血：根据造成人贫血病情的严重性将其分为4种类型。 地中海贫血：根据造成病情的严重性分为3种类型： 重型地中海贫血 中间型地中海贫血 轻型地中海贫血,地中海贫血(地贫)的类型,缺失一个基因尚有部分链合成者，+地贫； 缺失两个基因链完全不能合成者，0地贫。,4个基因缺失珠蛋白缺失4/高氧亲和力组织严重缺氧,A.Hb Barts胎儿水肿综合症,3个缺失4,B.血红蛋白H病（0/+）,高氧亲和力组织缺氧,H包涵体溶血贫血,C. 标准型地中海贫血 （0/A或+/+）,D. 静止型地中海贫血（+/A）,重型地贫：(00 、+、00 ) 轻型地贫：(
3、0A 、0A、0A ) 中间型地贫：(+(高F) +(高F) 、+) 遗传性胎儿血红蛋白持续增多症(HbF22),珠蛋白生成障碍性贫血,A.重型地中海贫血,患者不能合成链 链过剩而沉降到红细胞膜上，引起膜的性能改变，发生严重的溶血反应，引起肝脾增大。 组织缺氧，促进红细胞生成素分泌，刺激骨髓增生，骨质受损变得疏松，可出现鼻塌眼肿、上颔前突、头大额隆等特殊的“地中海贫血面容”。,B.中间型地中海贫血 一般是+地中海贫血基因的纯合子，患者的基因型通常为+（高F）+（高F）或+。病人的症状介于重型和轻型之间，故称为中间型。,C.轻型地中海贫血 发生于0或+地中海贫血基因的杂合子，无任何临床症状。,D
4、.遗传性胎儿血红蛋白持续增多症,HbF22 遗传缺陷导致和基因表达受到抑制，而链合成却异常增高，使成人红细胞内的胎儿血红蛋白HbF持续增多。,地中海贫血的分子机制,地中海贫血的分子机制, 地中海贫血的分子机制,基因缺失：缺失型地中海贫血 基因突变：非缺失型地中海贫血,基因缺失 基因突变,编码序列突变； 转录调控序列突变（TATA box)； RNA加工和修饰信号序列突变（GT-AG接头）,地中海贫血基因诊断,地中海贫血的基因诊断步骤,PCR 扩增 缺失型突变检测PCR 反应条件为:95预变性5min，98 45s，66 30s，72 3 min，35个循环，最后72延伸5 min。 非缺失型突
5、变检测PCR反应条件为:94预变性5 min，94 60s，55 30s，7260 s，35个循环，最后72延伸5min。,基因型分析 将上述PCR扩增产物与膜条100 变性10min，43 杂交2h以上，洗膜，加入酶标抗生物素蛋白，再次洗膜，加入酶底物显色，具体步骤按说明书进行操作。杂交及显色完成后，观察膜条上的蓝色斑点，若只有野生型探针处(N)显色，为该位点的野生纯合子;若只有突变型探针处(M)显色，为该位点的突变纯合子; 若野生型探针处(N)和突变型探针处(M)均显色，为该位点的杂合子。,地中海贫血的基因诊断结果 样本基因型 缺失型和非缺失型地贫基因突变检测结果见图1和图2。,图1 缺失
6、型地贫基因突变检测结果,图2 非缺失型地贫基因突变检测结果,地中海贫血的基因诊断步骤,PCR扩增 抽取受检者EDTA抗凝血2ml，按试剂盒操作说明书提取患者DNA,在A、B两管PCR反应液中分别加入提取的DNA 2ul。PCR反应条件为:93预变性5min; 93变性30s,复性60 30s,72延伸1min,35个循环;最后72延伸5min。,反向点杂交( reversedot-blot, RDB) 将上述PCR扩增产物与膜条100变性10min,42杂交4h以上,洗膜,加入酶标抗生物素蛋白,再次洗膜, 加入酶底物显色,观察结果。具体步骤按说明书进行操作。,杂交结果判定,杂交结果判定 杂交膜
7、条上结合的14种ASO探针排列顺序见表1。探针排列成3排,上排和中排分别对应8种常见突变位点的野生型(N)和突变型(M)探针,下排分别对应显色反应控制点,空白点和6种稀少突变位点的突变型(M)探针。杂交及显色完成后,显色反应控制点呈边缘清晰的蓝色圆点,否则需要重新检查杂交过程。所有的野生型(N)显色,突变型(M)不显色为正常人;某一位点的野生型(N)和突变型(M)均显色,为这一位点的杂合子;某一位点只有突变型(M)显色,野生型(N)不显色,为这一位点的突变纯合子;某两个位点的野生型(N)和突变型(M)均显色,为这两个位点的双重杂合子。,地中海贫血的基因诊断,5 种突变等位基因,关于基因治疗的展望,不久的将来,人类可望在基因的分子结构上自我认识,了解人体内60兆个细胞中的约10万个基因以及它们的特征和功能,这样影响人类健康的所有疾病均能作预防基因治疗,我们期待着这一天的早日到来。,参考文献,1地中海贫血88例基因诊断结果分析 2地中海贫血的基因诊断技术研究 3地中海贫血诊断与基因分型 4贵州地区_地中海贫血基因诊断 5遗传病的基因诊断和治疗 6医学遗传学理论与实践_5_遗传病的基因诊断和治疗 7遗传病的基因诊断与治疗研究进展 8孕妇地中海贫血的产前筛选与诊断 9在日本研究肿瘤的基因诊断与治疗,
