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1、第二军医大学 硕士学位论文 发形霞水母触手提取物细胞毒性 姓名：王倩倩 申请学位级别：硕士 专业：军事预防医学 指导教师：张黎明 20100501 发形霞水母触手提取物细胞毒性 捅要 随着海洋资源的开发利用和水母数量的增多，水母伤人事件越来越多，有毒水母 蜇伤成为最常见的海洋生物伤。水母毒素是一类结构新颖的肽类毒素，相对分子量从 1 0 , - 6 0 0k D a 不等，文献报道的活性成分差异显著。研究发现水母毒素具有细胞、心 血管、神经、肌肉、呼吸、循环、酶和皮肤坏死等多种生物活性，其中细胞毒性是水 母毒素最具普遍意义的生物活性，在水母蜇伤中毒中起重要作用。目前水母毒素研究 主要集中在毒素
2、对整体动物或离体脏器功能的影响等方面，更深入的细胞毒性作用及 其机制尚无明确报道，有待进一步研究。本文初步探讨了T O E 体内外溶红细胞毒性 作用及其作用机制，提出稀释的全血是一种比红细胞悬液更加方便有效的溶血活性测 定系统，并分析了T O E 对4 种离体细胞的毒性效应，测定毒素作用后细胞中C a p 、 A T P a s e 、M D A 等各个指标的变化，旨在从细胞水平研究T O E 的毒性作用。 方法为：首先，以红细胞为代表检测T O E 的溶细胞活性( 溶血活性) ，体外比较 S D 大鼠稀释的全血与红细胞悬液的溶血活性差异，观察各种金属阳离子对溶血活性 的影响；体内追踪T O
3、E 的溶血过程。观测T O E 对红细胞渗透脆性的影响，电镜观察 红细胞膜的变化，S C 5 b 9 测定试剂盒检测其在毒素作用前后活性水平。将稀释全血 和红细胞悬液两套测试系统扩展到包括人在内的其它几种动物血样进行比较研究，观 察抗氧化剂对溶血活性的影响，验证全血测试系统的实用性，利用血浆和血清白蛋白 干预探讨溶血的可能机制。其次，原代培养S D 大鼠血管平滑肌细胞( V S M C s ) ，与 多种肿瘤细胞相比较，M T T 法检测T O E 对所培养细胞生存率的影响，测定L D H 进 一步反映T O E 的细胞毒性作用，显微镜下观察细胞形态学变化。利用荧光探针F l u o 3 观测
4、T O E 作用后细胞内C a 2 + 的动态变化，利用试剂盒分别测定正常细胞与T O E 作用 后细胞C a 2 + 、A T P a s e 、M D A 、N O 等水平的变化。分别取T O E 作用前后大鼠胸主动 脉血管，组织匀浆后测定C a 2 + 含量变化。 结果表明，T O E 的溶血活性在大鼠稀释全血和红细胞悬液两个测试系统中都具 有剂量依赖性，且红细胞悬液中的溶血活性高于稀释全血。M n 2 + ，Z n 2 + ，L a 3 + ，C u 2 + 和 F e 2 + 能显著抑制T O E 的溶血活性。当给予T O E ( 5m g k gi V ) 后，麻醉S D 大鼠血清
5、O D 4 1 4 在前1 0m i n 显著快速上升，在接下来的3 小时内逐渐升高。最大和最小红细胞渗透 脆性在加入T O E ( 5m g k gi V ) 后随着时间延长明显增加。透射电镜观察给予T O E ( 5 m g k g ) 3 0m i n 后的S D 大鼠的动脉血细胞样本，发现在一些正常形态的红细胞表面有 大量未知的复合物。体外S C 5 b 9 复合物在与T O E 共培养后呈显著性上调，而静脉给 予T O E ( 5m g k g ) 1 8 0r a i n 内未见显著性差异。利用稀释全血和红细胞悬液两套溶血测 试系统做比较研究发现，红细胞悬液中的溶血活性普遍高于稀释
6、的全血。抗氧化剂 G S H 和V C 能抑制T O E 的溶血活性，蛋白酶抑制剂对溶血活性影响不明显。血清和 第二军医大学硕士学位论文 单纯的血浆成分一白蛋白对溶血活性有明显剂量依赖性的抑制作用。M T T 法检测结 果表明，T O E 对4 种贴壁细胞均产生细胞毒性作用，且原代培养的V S M C s 比3 种肿 瘤细胞对毒素作用更为敏感。毒素作用后，V S M C s 上清中L D H 活性较正常细胞上清 液明显升高。镜下观察不同浓度T O E 作用2 4h 后各组细胞的形态发现，随T O E 剂量 的升高，细胞漂浮、肿胀、折光性差等变化更加明显，大量细胞破裂、崩解、死亡。 F l u
7、o - 3 追踪T O E 作用后V S M C s 胞内c E + 的动态变化发现，1 0m i n 内胞内C a 2 + 出现 明显的升高过程，随之进入平原期，1 小时后又一次较大幅度的升高。T O E 作用后匀 浆细胞中C a 2 + 水平升高，而N 矿K + A T P a s e 及C a 2 + - A T P a s e 活性没有明显变化，M D A 及N O 变化也不明显。T O E 作用后S D 大鼠血管平滑肌组织匀浆也显示了C a 2 + 升高的 变化趋势。 本文首次同时使用稀释全血和红细胞悬液两套测试系统进行体外溶血活性检测， 发现T O E 在红细胞悬液中的溶血活性普遍
8、高于稀释的全血，表明血浆中白蛋白成分 可能具有溶血保护作用。T O E 在体内的溶血过程分为两个阶段：第一阶段为快速直 接的溶血，随后是渐进的溶血，体内溶血与体外溶血的过程是不一致的。综合多种阳 离子和抗氧化剂对溶血活性的影响、红细胞渗透脆性实验、透射电镜观察、S C 5 b - 9 活性测定等实验结果，推测氧化损伤和孔道形成在T O E 的溶血过程中起主要作用。 采用原代培养V S M C s 细胞检测T O E 对细胞的毒性作用，发现与肿瘤细胞相比， V S M C s 细胞对T O E 最为敏感，这进一步证明水母毒素作用靶点主要是心血管。T O E 作用后胞内钙水平出现升高一平衡一升高的
9、动态变化过程，说明胞内c E + 升高可能首先 是细胞膜损伤或通过离子通道发生钙内流引起的直接钙升高，其次可能是通过其它方 式间接引起的钙升高。通过T O E 作用前后C a 2 + 、A T P a s e 、M D A 、N O 等水平的变化 可以推测，毒素作用后细胞内钙超载可能是细胞死亡的直接原因。 关键词：发形霞水母，触手提取物，细胞毒性，溶血 发形霞水母触手提取物细胞毒性 A b s t r a c t W i t ht h ed e v e l o p m e n ta n du t i l i z a t i o no fm a r i n er e s o u r c e sa
10、 n dt h ei n c r e a s i n gn u m b e ro f j e l l y f i s h ，j e l l y f i s hs t i n g sa r eb e c o m i n gt h em o s tc o m m o nm a r i n el i f ei n j u r i e s J e l l y f i s h t o x i n sa r eag r o u po fn o v e lp e p t i d et o x i n s ，t h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h to f
11、w h i c ha r e r a n g i n gf r o m 10 - 6 0 0k D a S t u d i e si n d i c a t e dt h a tj e l l y f i s ht o x i n sp o s s e s sav a r i e t yo f b i o l o g i c a l a c t i v i t i e so n c a r d i o v a s c u l a r , n e r v e ，m u s c l e ，r e s p i r a t i o n , c i r c u l a t i o na n d c y
12、t o t o x i c i t y , o fw h i c ht h ec y t o t o x i c i t yi st h em o s tc o m m o nt o x i ni nt o x i cj e l l y f i s h S of a r , m o s to ft h er e p o r t sa b o u tj e l l y f i s ht o x i n sa r ef o c u s e do nt h el o c a la n ds y s t e m i cs y m p t o m s nv v oo ri ni s o l a t e
13、do r g a n ，w h i l et h es t u d i e sa b o u tt h ec e l l u l a rm e c h a n i s ma r ev e r yr a r e ， a n dr e q u i r ef u r t h e ri n v e s t i g a t i o n s I nt h i sp a p e r , t h ei nv i v oa n di nv i t r oh a e m o l y t i c a c t i v i t i e so fT O Ea r ee x a m i n e d ，r e s p e c
14、 t i v e l y , a n dt h ed i l u t e db l o o da san o v e lh a e m o l y t i c d e t e c t i o ns y s t e mi sc o m p a r a t i v e l ys t u d i e d 、析t l le r y t h r o c y t es u s p e n s i o n W ea l s oa n a l y z e d t h eo fT O Eo nV S M C sa n do t h e rt u m o rc e l l s ，a i m e dt o i n
15、v e s t i g a t et h ec e l l u l a r m e c h a n i s mo fT O Eb yt h ed e t e r m i n a t i o no fi n t r a c e l l u l a rc d + ，A T P a s e ，M D Aa n dN O ，。 F i r s t ，w ed e t e c t e dt h eh a e m o l y t i ca c t i v i t yo fT O E 加v i t r ou s i n gt h eb l o o ds a m p l ef r o m S Dr a t s
16、 ，a n ds t u d i e dt h eh a e m o l y t i ca c t i v i t yi nd i l u t e dw h o l eb l o o da n de r y t h r o c y t e s u s p e n s i o nc o m p a r a t i v e l y F a c t o r sa f f e c t i n gt h eh a e m o l y t i ca c t i v i t yw e r eo b s e r v e di nb o t h t h et e s ts y s t e m s W et r a c k e dt h eh a e m o l y t i cp r o c e s si nv i v o ，e x a m i n e dt h ei n f l u e n c eo f T O Eo ne r y t h r o c y t eo s m o t i cf r a g i l i t y , o b s e r v e d
