《发形霞水母触手提取物对大鼠离体心脏作用及其延迟毒性效应》由会员分享，可在线阅读，更多相关《发形霞水母触手提取物对大鼠离体心脏作用及其延迟毒性效应（66页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二军医大学 硕士学位论文 发形霞水母触手提取物对大鼠 离体心脏作用及其延迟毒性效应 E f f e c t sa n dm e c h a n i s m so ft e n t a c l e - o n l ye x t r a c tf r o m j e l l y f i s hC y a n e ac a p i l l a t ao nt h ei s o l a t e dr a ta n d o fw h i c h l e a d i n gd e l a y e d t o x i cs y n d r o m e 专业名称：军事预防医学 研究生姓名郭玉峰 导师姓名：张
2、黎明教授 培养单位：第二军医大学海医系 防化医学教研室 - 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明 的法律责任。 学位论文作者签名： 日期：年月 日 学位论文版权使用授权声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第 二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位 论文全文或部分内容编入中国学位
3、论文全文数据库、中国优秀博 硕士学位论文全文数据库等数据库进行检索。可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 日期：年月 日 日期：年月 日 目录 中文摘要O 00 0aO 0 00 000 1 英文摘要5 缩略词表9 1 L j 一 日I j 吾一一“”一“”一”“1 0 第一部分发形霞水母触手提取物对大鼠离体心脏作用1 1 材料和方法1 1 结果1 6 讨论2 5 第二部分发形霞水母触手提取物对大鼠的延迟毒性作用2 7 材料和方法2 7 结果3 1 讨论4 5 全文总结4 7 参考文献4 8 综j 苤5
4、 2 致谢5 9 附录6 0 i 发形霞水母触手提取物对大鼠离体心脏作用及其延迟毒性效应 摘要 背景和目的 近年来，水母爆发和水母蜇伤事件日益频繁，给海滨旅游业、近海渔业及水下作 业带来极大的危害，全世界每年被水母蛰伤的患者数以十万计，死者不在少数。水母 蜇伤后绝大部分情况下会产生皮肤瘙痒、刺痛、红肿等局部症状，严重时可以导 致呼吸、循环衰竭甚至死亡。 水母毒素是一类肽类毒素，具有溶血、神经、肌肉、呼吸、循环以及皮肤坏死等 多种生物毒性。心血管毒性是水母蜇伤的主要毒性之一，被认为是水母蜇伤致死的主 要原因。水母毒素研究从2 0 世纪6 0 年代起在水母危害最严重的澳大利亚就已经受到 关注和重视
5、，研究发现C h i r o n e xf l e c k e r i 、C h r y s a o r aq u i n q u e c i r r h a 、C h i r o p s a l m u s q u a d r i g a t u s 等从水母触手中提取的刺丝囊毒素( n e m a t o c y s tv e n o m ，N V ) 含有强烈的 心血管毒性。由于N V 含量极少，在提取和使用过程中其心血管毒性丧失明显，而各 实验室毒素提取方法又各不相同，导致实验研究结果差异很大，甚至有相互矛盾之处。 本实验室前期研究发现发形霞水母( C y a n e ac a p i
6、 l l a t a ) 触手提取物( t e n t a c l e o n l y e x t r a c t ，T O E ) 与N V 都具有明显的心脏毒性和细胞毒性，实验中用易于获得的T O E 代替N V 对水母毒素研究具有重要促进作用。 前期研究表明，C c a p i l l a t aT O E 对麻醉大鼠产生一个轻度而短暂的升血压反应后 伴随剧烈的血压下降，直至循环衰竭而死亡。但T O E 所引起的心血管毒性主要是全 身神经体液调节的结果还是直接作用于心脏所致，仅在整体动物实验的研究层面， 难以明确回答，且目前缺少水母毒素对离体心脏的影响及其机理的系统研究。因 此，本课题第
7、一部分采用L a n g e n d o r f f 离体心脏灌注模型，尽量排除神经体液因素 的影响，研究C c a p i l l a t aT O E 对大鼠离体心脏的影响。 另外，本实验室前期研究发现小鼠尾静脉注射T O E 研究其半数致死剂量L D s o 过 程中，通过血生化指标及血气分析结果，发现数分钟至2h 内急性死亡的小鼠死因主 要是急性心脏或神经相关毒性；而2h 至2 天内死亡的小鼠因除心脏受到毒素损伤外， 肝肾也明显受损，其死因目前尚不明确。因此，相对于数分钟至2h 内水母毒素所致 的以心血管毒性、神经毒性等为主的急性毒性反应，2h 4 8h 内由水母毒素引发 的以全身性多
8、器官损伤为主的一系列临床表现，我们称之为水母蜇伤迟发综合征 或者水母毒素延迟毒性综合征。水母毒素延迟毒性作用机理未见报道，而这种研 究相对于水母急性毒性更具有临床实际意义，因多数临床上的水母蜇伤患者急性 致死者的较少见，多数的受伤中毒者仪发生局部反应，但也有部分中毒者由于救 治的时机的延误或者致伤水母不同、中毒剂量不同可能发生水母蜇伤迟发综合征。 第二军医大学硕士学位论文 因此，本课题第二部分拟通过建立T O E 延迟毒性作用模型，研究水母毒素延迟毒 性的效应及作用机理。 研究方法 第一部分：T O E 对离体心脏作用。提取C c a p i l l a t aT O E 样品，并用K H 液
9、( p H 7 3 5 - 7 4 5 ) 透析。麻醉大鼠，开胸取心并悬挂于离体心脏灌流系统，左心室插入 球囊以记录左心室压，侧管推注给予不同剂量T O E ，观察3 0m i n ，全程监测H R 、 L V D P 、L V E D P 、d p d t 以及C F 等指标，连接心电导联记录大鼠离体心脏E C G ， 分析T O E 对大鼠离体心脏心功能以及心脏传导系统的影响。取T O E 作用后的大 鼠离体心脏，4 甲醛固定，常规病理检查：取T O E 作用后的大鼠离体心脏，4 多聚甲醛固定，透射电镜观察T O E 对心肌的影响。按上述方法分离、提取 C c a p i l l a t
10、aT O E 样品，采用碱变性以及缓冲液更换等方法制备去除溶血组分的 T O E 。使用前采用K H 液( p H7 3 5 7 4 5 ) 透析。麻醉大鼠，开胸取心并悬挂于离 体心脏灌流系统，左心室插入球囊以记录左心室压，侧管推注去溶血组分的T O E 0 3m g ，观察3 0r a i n ，全程监测H R 、L V D P 、L V E D P 、d p d t 以及C F 等指标，连 接心电导联记录大鼠离体心脏E C G 。取T O E 作用后的S D 大鼠离体心脏，4 甲 醛固定，常规病理检查及透射电镜观察T O E 对心肌的影响。分析T O E 与去溶血 组分的T O E 对大鼠
11、离体心脏影响的异同。 第二部分：T O E 的延迟毒性作用机理。将大鼠放入A L C H T P 动物恒温固定 器内，露出鼠尾，测定尾动脉收缩压, ( S y s t o l i cb l o o dp r e s s u r e s ，S B P ) 。在测量前， 利用恒温系统加热2 5r a i n ，温度设置在3 3 3 4 “ C 使大鼠尾动脉充分扩张，易于信 号传导。通过大鼠尾静脉注入O 2m L 1 0 0g 的T O E ，浓度分别为0ug k g ，9 0 | lg k g ， 18 0pg k g ，3 6 0l a g k g ，5 4 0l ag k g 以及实验对照(
12、3 6 0l ag k g 的T O E 经煮沸10 m i n 灭活) 。记录注射T O E 后0 2h ，2h ，4h ，6h ，8h 和1 0h 的S B P ，持续观察l0h ， 并记录死亡时间。注射T O E1 0h 后，将大鼠以2 5 乌拉坦腹腔麻醉( 1 0m g k g ) 后，取腹主动脉血液检测血生化指标。检测指标包括血常规，肝功能指标( T P 、 A L B 、G l o b 、A G 、A L T 、A S T 、L D H ) ，肾功能指标( U r e a 、C r e a l ，心肌酶谱( C K 、 C K M B ) ，血电解质f N a + 、K + 、C
13、a p 和C l 。) 。取空白对照组及高剂量组心、肺、肝 及肾等器官，常规病理检查和透射电镜观察，同时采用T U N E L 检测细胞凋亡情况。 结果 第一部分：T O E 对大鼠离体心脏作用。给予T O E 后，S D 大鼠离体心脏H R 、 L V D P 、d p d t 及C F 各项心功能指数呈剂量依赖性下降，而L V E D P 则呈剂量依赖 性上升。病理学检查显示部分心肌纤维变性。透射电镜显示部分心肌纤维断裂、 溶解、消失，线粒体发生肿胀，少量线粒体内部脊结构不清晰，遭到破坏。生化 发形霞水母触手提取物对大鼠离体心脏作用及其延迟毒性效应 分析显示L D H 、A S T 、C
14、K 、C K M B 等酶指标显著升高，提示心肌细胞受到破坏。 此外，由导出的E C G 发现，T O E 能够诱发离体心脏的心律失常，并具有剂量依赖 性，当T O EO 5m g 时，可诱发I I I 度房室传导阻滞。 经过碱变性、缓冲液透析，得到去除溶血活性的T O E 组分，去溶血活性的 T O E 组分相对于T O E 对离体心脏心电图影响并不明显，却仍然能够使H R 、L V D P 、 d p d t 及C F 各项心功能指数呈剂量依赖性下降，L V E D P 呈剂量依赖性上升，但作 用均较T O E 轻微。病理学检查发现，去溶血组分T O E 作用过的离体心脏，可见 心肌纤维变性。 第二部分：T O E 的延迟毒性作用机理 在给予不同剂量( 9 0g g k g 、1 8 0g g k g 、3 6 0g g k g ) 的T O E 后，观察1 0h 内 T O E 对大鼠无创尾动脉压影响。在给予
