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1、中南大学 博士学位论文 反义整合素连接激酶寡核苷酸对上皮-间充质转型的调控及抑制 喉癌转移的研究 姓名：吴平安 申请学位级别：博士 专业：耳鼻咽喉头颈外科学 指导教师：杨新明 20100501 博士学位论文 摘要 研究背景及目的：喉鳞状细胞癌( 1 a r y n g e a ls q u a m o u s c e l l c a r c i n o m a L S C C ) 是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，肿瘤浸润和转 移是造成喉癌患者死亡的主要原因之一，喉癌发生侵袭转移是一个 多环节、多步骤的复杂过程，包括肿瘤细胞粘附、移动、酶降解和 血管生成等多种肿瘤细胞的生物学行为，转移的确切机制目
2、前尚不 十分明确。 整合素连接激酶( i n t e g r i n 1 i n k e dk i n a s e ，I L K ) 是一个5 9 K D 的细胞 内信号蛋白，具有丝氨酸苏氨酸蛋白激酶活性。I L K 不仅在正常发 育中起着重要作用，其在肿瘤转移过程中也有着与其它已知的癌基 因一样的生物学效应。I L K 介导细胞与细胞外基质的连接，调节肌 动蛋白细胞骨架的运动，参与细胞粘附的形成，促进肿瘤细胞的粘 附和转移。 上皮一间充质转型( e p i t h e l i a l m e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n ，E M T ) 是多 细
3、胞生物形态学发生中的一个基本生理过程。是指上皮细胞向间质 细胞转分化的现象，在此过程中，上皮细胞极性丧失，迁移能力增 强，同时逐渐获得间质表型。上皮一间充质转型参与了上皮源性肿瘤 的发生及发展，尤其在癌的侵袭和转移方面。因此，对E M T 在肿瘤 形成和侵袭转移中的作用及其调控机制的研究正越来越受到人们的 关注。目前，I L K 作为一种E M T 的诱导因子， 在喉癌方面的研究几乎是一片空白。因此，我们以人喉鳞状细胞癌 细胞株H e p 2 为研究对象，采用反义I L K 寡核苷酸对其进行转染， 就I L K 对人喉鳞状细胞癌H e p 2 细胞上皮间充质转型的影响及其在 肿瘤侵袭、转移过程
4、中的作用和机制进行了研究。 方法：采用免疫组织化学法研究临床喉鳞状细胞癌标本中I L K 的表达与临床病理因素的相关性，并且进一步以人喉鳞状细胞癌细 胞株H e p 2 为研究对象，采用I L K 反义寡核苷酸对其进行转染，应 用M T T 、流式细胞术分析、W e s t e mB l o t 以及T r a n s w e l l 小室等分子 生物学技术和方法，深入研究了I L K 对人喉鳞状细胞癌H e p 2 细胞 上皮间充质转型相关基因表达的影响及其在肿瘤侵袭、转移过程中 的作用和机制。 博士学位论文 中文摘要 结果：I L K 在5 6 例喉鳞状细胞癌患者癌组织标本中的阳性表达 率
5、( 6 6 0 7 ) 明显高于I L K 在2 8 例癌旁组织中的阳性表达率 ( 2 1 4 3 ) ，统计学分析结果显示二者存在显著性差异( p 8 5 一 7 0 酒精中浸泡各5 分钟梯度水化，蒸馏水中浸泡5 分钟 后用P B S 冲洗三次，每次5 分钟； 2 ) 切片加入新鲜配置的3 双氧水甲醇过氧化物酶阻断液，以阻断内源性过氧化 物酶的活性，室温下孵育1 0 分钟，用P B S 冲洗三次，每次5 分钟； 3 ) 热修复：切片置于5 0 0 m l1 ：5 0 E D T A 抗原修复工作液中，微波炉加热至沸 腾，持续1 0 分钟。冷却后，加入蒸馏水补充至原量，再次加热至沸腾持续1 0
6、 分钟，以暴露修复抗原，室温下自然冷却后，蒸馏水洗1 次3 分钟，P B S 洗2 次，每次3 分钟； 4 ) 抗原封闭：切片滴加抗原封闭液，置于3 7 。C 恒温箱内孵育3 0 分钟取出，不 洗； 5 ) 滴加一抗：切片滴加适量的兔抗人I L K 多克隆抗体( 浓度l ：2 0 0 ) ，3 7 “ C 恒温水 浴箱内孵育6 0 分钟或4 。C 下过夜，P B S 漂洗3 次，每次5 分钟。 6 ) 滴N - - 抗：切片滴加辣根过氧化物酶( H R P ) 标记羊抗兔I g G 第二抗体( 1 ： 1 0 0 ) ，置于3 7 “ C 恒温箱内，孵育3 0 分钟，P B S 漂洗3 次，每
7、次5 分钟。 7 ) 滴加S A B C 液：切片滴加链亲和素过氧化物酶液( S A B C 液) ，置于3 7 恒 8 博十学位论文第一部分 温箱内，孵育3 0 分钟，用P B S 冲洗三次，每次5 分钟。 8 ) D A B 显色：切片滴加新鲜配制的D A B 显色溶液，显微镜下观察5 “ 1 0 分钟 控制显色。 9 ) 流水冲洗1 0 分钟一蒸馏水略浸泡一苏木苏染色3 0 秒一流水略浸泡一盐酸溶 液中略浸泡一流水略浸泡一碳酸钾溶液中浸泡1 分钟一流水冲洗l O 分钟一6 0 烤箱内烘干一中性树胶封片。 1 2 3 1 3 结果评判标准 染色判定标准参照S h i m i z u 方法【
8、3 1 】进行评定和积分。每批次均以P B S 代 替一抗作阴性对照组，采用双盲法，高倍镜下每张切片避开边缘区域，随机选 取5 个视野，用微测量网格记数4 0 0 个细胞中阳性细胞所占比例的平均值作为 阳性率。采用兼顾阳性染色强度和阳性细胞所占百分比的判断标准，按染色强 度评分：阴性无色为0 分，弱阳性淡黄色为1 分，阳性黄色为2 分，强阳性棕 黄色为3 分。按阳性细胞所占的百分比评分：阴性为0 分，阳性细胞冬1 0 为1 分，1 1 2 5 为2 分，2 6 5 0 为3 分， 5 0 为4 分。染色强度与阳性细胞所占 百分比评分的乘积 3 为免疫反应阳性。并按乘积分数分为3 个等级：一(
9、O 3 分) ，+ ( 4 6 分) ，+ + ( 7 - 一9 分) ，+ + + ( 1 0 1 2 分) ，定义“一”和“+ 为阴性表达：“+ + ”和“+ + + ”为阳性表达。 1 2 3 2 免疫细胞化学 ， 细胞爬片制作：处于对数生长期H e p 2 细胞，0 2 5 胰酶E D T A 消化液消化， 细胞计数，调节细胞浓度至5 X 1 0 5 m l ，滴加6 0 1 x l 到洁净的盖玻片上，使其覆盖 整个玻片，3 7 ，5 C 0 2 孵育1 h ，后加入适量含1 0 胎牛血清的R P M I 1 6 4 0 培 养基，3 7 ，5 C 0 2 孵育2 4 h 。 细胞免疫
10、组化以O 0 1 M P B S 液代替一抗作为阴性对照，具体步骤如下： 1 ) 吸尽培养液，P B S 洗涤3 次，每次5 分钟。 2 ) 吸出P B S ，以4 多聚甲醛液覆盖细胞约2 - 3 m m ，室温下固定2 0 分钟 3 ) 吸出固定剂，P B S 清洗3 次，每次5 分钟。 4 ) 每张切片加入5 0I Il 现配3 H 2 0 2 甲醇溶液中室温孵育1 0 m i n ，P B S 清洗3 次， 每次5 分钟。 5 ) 每张切片加入5 0l al 抗原封闭液封闭，置于3 7 。C ，孵育2 5 m i n 。 6 ) 吸去封闭液，每张切片加入5 0ul 用P B S T r
11、i t o n 稀释的兔抗人I L K 多克隆抗 体( 浓度l ：2 0 0 ) ，以P B S 取代一抗作为染色阴性对照3 7 。C 恒温水浴箱内孵育6 0 分 钟或4 下过夜，P B S 漂洗3 次，每次5 分钟。 7 ) 每张切片加入5 0ul 辣根过氧化物酶( H R P ) 标记羊抗兔I g G 第二抗体( 1 ： 1 0 0 ) ，置于3 7 恒温箱内，孵育3 0 分钟，P B S 漂洗3 次，每次5 分钟。 9 博士学位论文第一部分 8 ) 滴加S A B C 液：每张切片加入5 0ul 链亲和素过氧化物酶液( S A B C 液) ， 置丁3 7 “ C 恒温箱内，孵育3 0
12、分钟，用P B S 冲洗三次，每次5 分钟。 9 ) D A B 显色：每张切片加入1 0 0ul 新鲜配制的D A B 显色溶液，显微镜下观 察5 1 0 分钟控制显色。 l o ) 流水冲洗1 0 分钟一蒸馏水略浸泡一苏木苏染色3 0 秒一流水略浸泡一盐酸溶 液中略浸泡一流水略浸泡一碳酸钾溶液中浸泡1 分钟一流水冲洗1 0 分钟- * - 6 0 烤箱内烘干一中性树胶封片。 1 3 统计方法 运用S P S S l 3 0 软件，对I L K 蛋白表达与临床病理特征的关系采用卡方检 验，P 6 0 S u p r a g l o t t i c g l o t t i c s u b g
13、l o t t i c T 1 T 2 T 3 T 4 G 1 G 2 G 3 N O 盯 2 4 3 2 1 9 3 2 5 1 8 3 8 2 3 2 3 1 0 2 4 3 2 8 1 1 6 1 l 2 6 1 3 1 2 6 1 1 2 7 1 6 0 5 8 2 2 l 1 4 2 20 9 0 8 3 1 2 0 9 4 8 2 5 l l 1 70 0 3 7 * 9 1 2 0 0 2 8 * 2 5 2 2 免疫细胞化学检测人喉鳞状细胞癌H e p 一2 细胞内I L K 的表达 人喉鳞状细胞癌H c p 一2 细胞的细胞浆和细胞核中均有I L K 表达，且主要以 胞浆表达
14、为主，胞浆中出现黄色颗粒样物，图2 2 。 1 2 博十学位论文第一部分 蠢譬? 密奄 I 麓 晦 2 Z 飞j 奄。 。遵蠢矗_ u 弹 警、：芬“矗 写豁硬! t 可 矗 - ；一裂一、锥蘑y 。，孳- 朱建I lk 一曲，。毫臻， 圈一锫癌肚堂蛤涮1 4 I o n细晦由T lv 的嘉妆 n n 、 3 讨论 喉部恶性肿瘤是耳鼻咽喉科最常见的恶性肿瘤之一，占全身恶性肿瘤的 2 1 5 ，以鳞状细胞癌最为多见，约占9 8 ，其他如腺癌、基底细胞癌、未 分化癌、淋巴肉瘤和恶性淋巴瘤等较少见H “1o 手术治疗是喉痛的主要治疗 手段，其他治疗手段包括放疗、化疗、免疫治疗等，随着诊断和治疗水平的
15、提 高，早期喉癌的五年生存率已达7 0 以上，但晚期喉癌，尤其是有淋巴结转移 者，五年生存率仍在5 0 以F 【2 J 。喉癌的发生发展是一个多基因参与、多步骤 的复杂过程。阐明喉癌发生发展的原冈及作用机制，以期做到早发现、早诊断、 早治疗，对于提高患者的生存率和生活质量，无疑有重大意义。 整合素连接激酶( I n t e g r i n 1 i n k e dk i n a s e ，I L K ) 是一个独特的具有衍接蛋白 和激酶活性的细胞内信号蛋白，结构包含一个氨基端四个a n k y r i n 重复序列，一 个中心区P H 样结构域( p l e c k s t r i nh o m
16、 o l o g y l i k ed o m a i n ) 和一个羧基端激酶结 构域。I L K 氨基端a n k y r i n 重复序列结合多种调节因子及信号分子，如P I N C H ( p a r t i c u l a r l yi n t e r e s t i n gn e wc y s t e i n e h i s t i d i n ep r o t e i n a l s ok n o w na sL I M S I ) 【3 3 】 和I L K A P ( I L K a s s o c i a t e dp h o s p h a t a s e ) 1 3 4 1 ，对I L K 在粘着斑中的定位并调节 它的功能有重要作用。中心区P H 样结构域可被磷酸肌醇脂结合激活，如3 ，4 ，5 一 三磷酸磷脂酰肌醇( p h o s p h
