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1、1 5 6 中国植物病理学会2 0 0 6 年学术年会论文集 双生病毒的种群遗传结构和遗传变异 葛林梅李红叶周雪平 ( 浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所，杭州3 1 0 0 2 9 ) 在病毒研究领域，有关R N A 病毒，特别是动物R N A 病毒的种群遗传特点已有相当多和 相当深入的研究，一般认为，植物R N A 病毒与动物R N A 病毒类似，其种群，甚至同一个分 子克隆后代群体实质上是由围绕一个或几个保守序列( c o n s e n s u ss e q u e n c e ) 的一群序列突交 体的集合，这些变异体序列相近但不完全一致，交异体的分布是复杂而且处于不断变化中。
2、有人将R N A 病毒这种种群遗传结构特征称之为准种( q u a s i s p e c i e s ) ( D o m i n g oa n dH o l l a n d , 1 9 9 4 ) ，而且普遍推测R N A 病毒这种种群结构特点是与其自身编码的依赖R N A 的R N A 聚合 酶( R d R p ) 即复制酶缺乏校正功能相关。R N A 病毒的复制酶是由R N A 病毒自身编码的，病 毒的复制是在寄主的细胞质内进行，寄主植物的某些组分参与R N A 病毒的复制过程。与此不 同，双生病毒这一类D N A 病毒的复制是在寄主的细胞核内进行，复制酶为寄主植物编码的 D N A
3、聚合酶，病毒自身编码有关组分对复制具增强作用。因此，理论上双生病毒种群变异要 小于R N A 病毒( D o m i n g oe ta 1 ，1 9 9 6 ) 。然而，来自自然种群的序列分析表明，双生病毒，特 别是菜豆金色花叶病毒属，无论在种间或种内均具有丰富的遗传多样性( S a n z , e t a l ，1 9 9 9 ) 。 已有的研究认为重组是构成这类病毒丰富变异的机制之一( H a r r i s o na n dR o b i n s o n ，1 9 9 9 ) 。 在某种意义上可以认为，任何一个植物病毒病的流行都与人类自身活动分不开。集约化 的农业生产为适应某种或某个品
4、种作物的病原类型提供了有利的条件，并且也为病原变异体 提供了定向的选择压，使适应特定物种或品种病原变异体得以被选择，并发展成为优势种群； 便利的交通，频繁的农产品贸易和广泛繁殖材料交流大大增加和加速病原物的扩散。随着科 学发展，化学防治，生物防治成为植物真菌性病害和细菌性病害的有效防治途径之一。然而， 植物病毒病害的化学控制尚未突破，病毒病害的控制主要依赖抗病品种，故任何新的病毒变 异体的出现，并发展形成种群均有可能带来对原有的抗病品种的克服，造成破坏性病害流行。 1 9 9 2 年以来发生在东非的木薯花叶病毒病( E a s t A f r i c a nc a s s a v am o s
5、 a i cv h u s ，E A C M V ) 和发 生在巴基斯坦的棉花曲叶病毒( C o t t o n 拓矿c u r lv i r u s ，C L C u V ) 给当地带来的巨大经济损失就 是典型的例子( H a r r i s o na n dR o b i n s o n ，1 9 9 9 ；B r i d d o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) 。了解病毒种群的变化规律 是预测病害流行，进行抗病育种，有效控制病毒病为害的前提。 对植物R N A 病毒的种群结构以及种群遗传多样性已有较多的研究( G a r c i a - A r e n a l ，e ta 1 2
6、0 0 1 ；S c h n e i d e ra n dR o o s s i n c k , 2 0 0 0 ，2 0 0 1 ) 。相反，有关植物D N A 病毒的相应的研究寥寥无几 国家自然科学基金资助( 3 0 4 7 0 0 7 8 ) 通讯作者：李红叶和周雪平 病毒及病毒病害1 5 7 ( S a n z e ta 1 ，1 9 9 9 ；I s n a r de ta L ，1 9 9 8 ) 。双生病毒是植物病毒中唯一一类具有孪生颗粒形态的单 链环状D N A 病毒。双生病毒科( G e m i n i v i r i d a e ) 4 个属中的菜豆金色花叶病毒属( B e
7、 g o m o v i r u s ) 是最具经济重要性的双生病毒，该属病毒引起的病害发生呈逐年上升趋势，引起广泛的关注。 本研究试图通过以中国番茄黄化曲叶病毒( T o m a t o y e l l o wt e a l c u r lC h i n av i r u s ，T Y L C C N V ) ( X i ee t 以，2 0 0 3 ) Y 1 0 分离物D N A - A 为材料，从序列一致的分子克隆出发，在实验室条件 下探讨双生病毒种群结构特征，遗传多样性水平和变异规律，为解析双生病毒进化和病害爆 发机制和预测流行趋势提供理论依据。 1 实验材料与方法 1 1 实验材料
8、 本生烟( N i c o t i a n ab e n t h a m i a n a ) ，番茄( L y c o p e r s i c o n e s c p l t e n t u m ) 培养在无昆虫、光温 控制的植物培养房内：T Y L C C N V - Y 1 0D N A - A ( p B i n - Y 1 0 A - 1 7 m e r ) 和D N A l 3 ( p B i n - Y 1 0 1 3 一d i m e r ) 侵染性克隆( C u ie ta 1 ，2 0 0 4 ) ，均来自浙江大学农业与生物技术学院生 物技术研究所周雪平教授实验室。 1 2
9、实验方法 人工韧皮部注射接种携带T Y L C C N VY 10 和Y 10 p 侵染性克隆的农杆菌菌液( E H A10 5 ) 至4 “ - 6 叶期的本生烟和番茄。接种6 0 d 后选取3 株产生典型症状的本生烟和番茄，分别在 3 0 d 、6 0 d 和1 2 0 d 取样( 取新生叶片组织) ，并分别提取植物基因组D N A ，零下2 0 保存。 选取3 个接种后6 0 d 和1 个接种1 2 0 d 的本生烟，以及1 个接种6 0 d 的番茄D N A 样品，以Y 1 0 特异性引物，P C R 扩增涵盖I R 和A C l 区间的片断( 1 3 5 8 b p ) ，连接、转化
10、后，每个样品随机 挑取1 6 2 4 个克隆进行测序。所得的序列与原始序列( 接种的侵染性克隆) 进行比较，存在 与原来序列不一致的克隆定为突变克隆，总的突变碱基数除以测序的总碱基数，再乘以1 0 0 为突变频率。同时，以Y I O 侵染性克隆作模板扩增相同的片段，随机挑取1 6 个克隆直接测 序，以比较P C R 过程的错配对实验结果的影响程度。另外，还以同样的方法分析自然感染 n 几C C N V - Y 1 0 的番茄植株中的病毒种群结构。 2 结果 本实验结果总结于表1 。在接种本生烟6 0 d 后，3 株植物，N B 6 0 1 、N B 6 0 2 、N B 6 0 3 中 的病毒
11、种群均是杂合的，原始序列仍然为主序列，与之相伴的是一些相似，但不完全一致的 序列变异体。这种现象也同样出现在接种番茄的种群中( 表1 ) 。种群变异性或遗传多样性( 以 1 5 8中国植物病理学会2 0 0 6 年学术年会论文集 突变的克隆百分率和突变频率为指标) 在分析的3 株本生烟中非常的相近，这说明了本实验 的重演性非常好，测定结果可以反应植株中病毒的群体遗传结构的实际情况( 表1 ) 。以侵染 性克隆作模板，获得的群体，无论在突变克隆百分率，还是核苷酸的突变频率上均显著的低 于来自经过在本生烟或番茄中增殖过的群体。说明，检测到的突变主要来自病毒在寄主体内 的增殖过程。比较T Y L C
12、 C N V 病毒群体在本生烟和番茄上的变异性，并没有发现寄主种类对 病毒种群变异的影响( 表1 ) 。 再过6 0 d ，也即接种后1 2 0 d 再次分析其中l 株本生烟上的病毒群体结构，发现其种群仍 然是杂合的，核苷酸突变频率为6 1 4 x 1 0 4 ，这与接种后6 0 d 种群平均值相比表现稍有增加， 突变克隆百分率也表现一致的现象( 表1 ) 。但统计分析表明，这个差异并不显著，说明种群 多样性对一种病毒，在同一种寄主上来说可能是恒定的( S c h n e i d e ra n dR o o s s i n c k ，2 0 0 0 ，2 0 0 1 ) 。 序列分析表明原始序
13、列仍然为主序列，绝大多数在接种后6 0 d 检测到的突变体，在1 2 0 d 时并 没有检测到，只有少数突变体能被再次检测到，说明T Y L C C N V 突变体分布处于不断变化中， 绝大部分复制过程中产生的突变体因选择或遗传瓶颈关系( L ia n dR o o s s i n c k 2 0 0 4 ) 被淘汰，病 毒的复制过程又产生一些新的突变体。 表1T Y L C C N VY 1 0 接种本生烟和番茄6 0 d 、1 2 0 d 后其后代种群的变异 T a b l e1 V a r i a t i o ni np r o g e n yp o p p l a t i o no f
14、T Y L C C N V - Y I Oi nNb e n t h a m i a n aa n dL e s c p l t e n t u ma t6 0a n d 1 2 0d a y sp o s ti n f e c t i o n ( D P I ) P ，a n tD P N 。m 。：现。a ，c 芝：I ；s ：e ；f m u a 1 0 _ n s N 。醒M f r u e t q a t 。e i n o n c y 分析自然感染T Y L C C N V 的番茄中的病毒群体，发现存在两个遗传上显然不同的亚群体， 我们称之为s u b g r o u pA 和s u
15、 b g r o u pB ，它们之间的序列致性达9 3 ，推测是来自2 个具有 明显差异的亚群体的混合感染。在分析的1 6 个克隆中，s u b g r o u pA 占1 4 个，s u b g r o u pB 占2 个，s u b g r o u pB 之间的序列完全一致，s u b g r o u o pA 则又是一个遗传上杂合的群体。如果撇开 s u b g r o u pB ，单独计算s u b g r o u pA 的种群遗传多样性程度，发现突变克隆百分率和碱基突变 频率均与实验条件下所得的结果具有可比性。 病毒及病毒病害 1 5 9 3 结论 通过以上人工接种序列一致的分子克
16、隆和田间自然感染T Y L C C N V 样品中的T Y L C C N V 种群结构特征和遗传多样性分析，首次证明D N A 病毒( 至少双生病毒) 具有与植物R N A 病 毒类似的种群结构特征和遗传多样性程度，其群体为一条主序列和一群与该主序列的变异体 组成，而且其变异体谱是动态的。 参考文献 【1 】S a n zA I , F r a i l eA G a l l e g oJ M , M a l p i c aJ M , G a r c l a - A r a n a lE ( 1 9 9 9 ) G e n e t i cv a r i a b i l i t yo fn a t u r a lp o p p l a t i o n so fc o t t o nl e a fc u r l g e m i n i v i m s , as i n g l e - s t r a n d e dD N Av i r u s JM 0 1 E v 0 1 4 9 ：6
